[发明专利]基于基因组编辑的外显子跳跃诱导方法

说明书

本发明提供一种使用CRISPR‑Cas和向导RNA的、用于跳过基因组上的靶基因的靶外显子的方法，其特征在于，所述向导RNA具有使CRISPR‑Cas切断位点配置在距离靶外显子的紧前方的剪接供体位点或靶外显子的紧后方的剪接受体位点80个碱基以内的位置的间隔序列。

技术领域

本发明涉及基因重组技术，涉及在研究领域、医疗领域中有用的基于基因组编辑的外显子跳跃诱导方法。

背景技术

杜兴氏肌营养不良(Duchenne muscular dystrophy，以下记作DMD)是由于抗肌萎缩蛋白(dystrophin)基因的功能丧失、从而肌纤维萎缩的疾病。抗肌萎缩蛋白基因的骨骼肌同种型(Dp427m)由79个外显子构成，其中的一部分缺损等则导致基因的阅读框移位，从而不能正常形成抗肌萎缩蛋白、引起DMD(非专利文献1)。

为了根治DMD，对从外部添加有功能的抗肌萎缩蛋白基因来代替功能不全的内源性抗肌萎缩蛋白基因的基因治疗法也进行了各种研究。抗肌萎缩蛋白的全长cDNA的尺寸达14kb，因此尝试了将不需要的结构域部分切除而制作小型化的迷你抗肌萎缩蛋白、微抗肌萎缩蛋白且使用各种基因导入载体(AAV、慢病毒、睡美人(Sleeping Beauty)转座子载体等)导入肌肉组织的方法。但是，难以将庞大的基因导入，尚未建立有效的治疗方法。

还进行了以下研究：使用反义寡核苷酸来避免mRNA剪接时对特定的外显子进行部分读取的情况，从而修复为具有正常功能的抗肌萎缩蛋白(外显子跳跃)，但反义寡核苷酸的效果为一过性的，对于根本性治疗而言，需要对基因本身进行修复的方法。

作为对基因本身进行修复的方法，近年开发了TALEN、CRISPR-Cas系统之类的基因组编辑技术。这些技术为如下技术：通过从基因组序列中识别特定的序列位置并诱导DNA双链的切断，从而在局部诱导非同源重组(Non-homologous end joining，NHEJ)、同源重组(Homology directed repair，HDR)介导的DNA修复机制，从而可以在切断位置添加或删除碱基。

CRISPR-Cas基因组编辑技术中广泛使用细菌、古细菌所具有的Type II或Type VCRISPR系统，可以向导RNA(gRNA或sgRNA)所含的间隔序列依赖性地与靶DNA结合并在Cas核酸酶(Type II的情况下为Cas9，Type V的情况下为Cpf1)的作用下诱导双链DNA的切断。在Type II CRISPR系统中，向导RNA为crRNA与tracrRNA的复合体、或者crRNA与tracrRNA连接而成的sgRNA(single guide RNA，一个向导RNA)。

已经报道了在成肌细胞[非专利文献2、3]、mdx小鼠水平[非专利文献4～7]进行利用基因组编辑技术的抗肌萎缩蛋白的外显子跳跃。

这些研究中采取的是使用两个向导RNA来切断所跳跃的外显子的两端、对几乎整个外显子诱导大的缺损的方法，该方法的情况下，需要两个gRNA，从而引起非特异性切断的风险增加。另外，仅用任意一个gRNA进行切断时不能彻底诱导外显子跳跃，需要两个gRNA序列作用于同一基因组。另外，需要删除至少数百个碱基，在该区域中包含未知的调控区域、miRNA的编码区域的情况下，还存在引起不可预期的副作用的风险。

另一方面，本发明人们以前报道了：通过在DMD患者来源的iPS细胞中使用TALEN、CRISPR-Cas9之类的基因组编辑技术，可以基于(1)外显子跳跃、(2)移码诱导、以及(3)缺损外显子的敲入修复抗肌萎缩蛋白的基因变异[非专利文献8]。其中，(1)的方法采用删除外显子的剪接受体的方法，如果可以用一个gRNA诱导数个碱基至数十个碱基的缺损则可以充分诱导外显子跳跃，因此与上述的[非专利文献2～7]中报道的方法相比，在效率高、副作用即变异的风险小、删除极少的DNA碱基即可这3方面更为优异。