[发明专利]以高收率分离RNA的方法

说明书

本文提供了一种从样品中分离核酸的无苯酚方法，所述方法包括以下步骤：a)向样品添加沉淀缓冲液以制备酸性沉淀混合物，其中所述沉淀缓冲液包含金属阳离子沉淀剂和缓冲剂、pH值为4.0或更低并且不包含选自非质子极性溶剂和质子溶剂的有机溶剂，并且其中所述酸性沉淀混合物包含浓度小于200mM的金属阳离子沉淀剂，并沉淀蛋白质；b)将沉淀物与上清液分离，其中上清液包含长度小于200nt的小RNA和长度为至少1000nt的大RNA；以及c)从上清液中分离核酸。本方法可以避免在蛋白质沉淀期间使用有机溶剂。还提供了一种沉淀缓冲液。

本发明涉及一种从样品中分离核酸例如RNA的方法，并且特别地提供了通过使用无苯酚RNA分离法，从各种样品、包括富蛋白质的样品中以高收率有效地分离小RNA和大RNA的手段。

对来自各种组织、体液和其他生物样品中的200个核苷酸或更少级别的小核酸的研究是一个极为受关注的领域并且未来有望继续保持。小核酸特别包括但不限于小RNA，例如，尤其是微小RNA(miRNA)和小干扰RNA分子，它们两个都可以对基因表达具有强大影响。此外，参与mRNA和rRNA加工的其他核小RNA和核仁小RNA(例如snRNA和snoRNA)也受到关注。此外，诸如长度为500个核苷酸或更少的RNA之类的核酸也经常作为降解产物包含在其他样品中，并且必须从中有效捕获。随着对各个小RNA的兴趣日益增加，标准分离程序已经得到了修正，以促进小核酸的分离和改善小核酸的收率。这样的改进是必要的，因为用于分离总RNA的标准方案通常对于分离小RNA不理想，原因在于使用标准方法往往无法有效结合小RNA。因此，使用标准程序分离的总RNA通常不包含足量的小RNA用于后续分析。这些低收率可归因于小RNA在核酸分离过程期间未结合或丢失。因此，开发了可以有效分离总RNA、包括期望的小RNA或从样品中选择性分离小RNA(没有较大RNA)的方法。

设计用来分离小RNA、例如特别是小单链RNA如miRNA的常用方法在结合期间需要≥45％或优选≥50％的相当高的醇浓度，以确保小RNA与核酸结合固相的有效结合。结合效率随着醇浓度的增加而增加。但是，这些为了确保RNA与固相有效结合所需的高醇浓度造成了干扰分离程序的问题。特别是当处理富蛋白质的样品例如血浆、血清或组织样品时，RNA结合步骤期间所需的高醇浓度会导致蛋白质沉淀到固相上。这些沉淀物是干扰分离程序的污染物，因为它们例如非特异性地与固相结合并由此阻塞固相和/或作为污染物被带入洗脱物中。

因此，从富蛋白质的样品中分离小RNA的既定方法包括在建立允许结合小RNA的结合条件之前的蛋白质去除步骤。蛋白质去除技术包括例如苯酚/氯仿提取或蛋白质沉淀步骤。其他方法采用耗时的酶促蛋白质消化步骤，例如用蛋白酶K消化。或者，大幅稀释样品或降低结合期间的醇浓度，这具有降低分离效率的缺点。与这些已知方法相关的问题随后将进一步详细描述。