[发明专利]一种新型甲基化建库试剂盒及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，特别是涉及一种新型甲基化建库试剂盒及其应用。

背景技术

甲基化是最常见的表观遗传修饰方式之一，在不改变核酸序列的前提下，调控基因的表达。DNA甲基化通常是指在DNA甲基转移酶的介导下，在胞嘧啶的第5位碳原子上加上一个甲基基团，使之变成5-甲基胞嘧啶(5-mC)。甲基化修饰在基因印迹、基因表达调控、X染色体失活、癌症发生与发展等方面发挥重要作用。

DNA甲基化异常可通过影响原癌基因和抑癌基因的表达而参与肿瘤的形成。当肿瘤发生时，抑癌基因通常发生整体的高甲基化，尤其是CpG岛区域，从而抑制基因的表达，从而导致癌症的发生。另一方面原癌基因则发生大规模的去甲基化，导致原癌基因的激活而导致基因表达量的升高，进一步是癌症发生或恶化。

近年来测序技术发展迅猛，已成为生物学研究的重要手段。高通量测序技术的兴起，使大规模、低成本研究DNA序列以及DNA序列的表观修饰成为可能。以甲基化修饰为代表的DNA的表观修饰一直以来都是研究热点。

目前对于甲基化的研究方式们通常还是通过双链连接接头后进行重亚硫酸盐转化后扩增的方式进行。该方案对样品的起始量有着较高的要求，对于组织样品通常需要微克(μg)级的DNA起始量。但是由于甲基化的研究中的金标准--重亚硫酸盐处理，需要将DNA变性成单链，并且会造成样品的随机断裂，而造成文库信息的极大损失。

广州市基准医疗有限公司的专利(专利号：CN 106854679 A)，提出采用单链连接或环化的方式进行cfDNA样品的甲基化研究，该方案能对经过重亚硫酸转化的DNA进行较好的扩增，但是该方案中所需的酶(circligase)价格昂贵，若用其他酶进行替代则会造成连接效率的极大下降。另外该方案的滚环扩增或反向PCR扩增后，若需进行文库构建，则需要进行常规的文库构建流程，操作繁琐。

Swift Biosciences公司的SWIFT Accel-NGS-Methyl-Seq方法，提供的也是单链连接的方式进行文库构建。如广州市基准医疗有限公司的专利(专利号：CN 106854679 A)中所述，该方案的链接效率低，并且该商业化试剂盒的价格昂贵。

目前对于甲基化样品进行扩增的实验方案主要包括下表中列举的双链接头连接扩增、单链环化、单链接头连接、随机引物扩增等，具体方案见表一。

表一 常用的DNA甲基化扩增及建库实验方案

以上现有技术的缺点如下：

一、双链接头连接

双链接头连接的方式，需要的DNA长需要达到ug级，这对许多珍稀样品，是无法实现的。另外双链连接的方式需要在加接头后进行重亚硫酸盐的处理，该处理需要DNA为单链模式方能发挥作用，同时会对DNA造成随机的断裂损伤。这部分断裂的DNA在后续的PCR扩增中是无法进行扩增的，这就造成了信息不可逆的丢失。

二、单链接头连接

单链接头连接的方式进行甲基化文库的构建存在连接效率低的问题。

三、随机引物扩增法

由于随机引物在结合到目的片段的时候具有一定的片段选择性，因此会造成最终样品的偏向性。另外随机引物的扩增方案，通常由于引物结合的随机性而造成再比对的时候只能采用单端比对的模式比对到参考基因组，而造成比对精确性的下降。

四、自身连接成环的扩增方法

自身连接成环的方式需要使用circligase，第一，该酶会优先进行分子内的环化，因此如果需要接入接头进行预扩增的话，则相对链接效率会有极大的下降。第二，该酶对于目标分子的连接是有序列选择性的，对于3’末端是C的分子没有连接能力，对于5’末端是A/T/C的分子的连接效率要远远小于5’末端是G的分子，因此存在严重的偏向性。第三，该酶价格昂贵。

针对以上问题，急需一种新型甲基化建库产品。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种新型甲基化建库试剂盒及其应用。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明的第一方面提供了一种甲基化建库试剂盒，至少包括：重亚硫酸盐转化试剂、黏性末端接头、连接酶、DNA延伸试剂、以及DNA扩增试剂。

进一步地，所述重亚硫酸盐转化试剂用于对样本的基因组DNA进行重亚硫酸盐转化。