[发明专利]一种检测结直肠癌易感基因突变的试剂盒及其检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术中的基因突变检测领域，更具体涉及一种检测结直肠癌易感基因突变的试剂盒及其检测方法。

背景技术

结直肠癌(colorectal cancer，CRC)是结肠癌和直肠癌的总称，也称为大肠癌，指大肠粘膜上皮在环境或遗传等多种致癌因素作用下发生的癌变。结直肠癌是一种常见的消化系统恶性肿瘤，其发病率和死亡率居全球恶性肿瘤第三位，且呈逐年上升的趋势。结直肠癌早期症状如大便次数增多、大便有粘液和脓血，易误诊为痢疾、肠炎或痔疮等疾病，误诊率高达30％。

据统计，无侵袭转移的结直肠患者的5年生存率可高达90％，有局部转移者的5年生存率有68％，而带有远处转移者的5年生存率则仅有11％。因此早期发现是改善结直肠癌预后的关键。目前主要的结直肠癌筛查手段均有不同程度的缺陷：(1)常规血检类，特异性敏感性不强，对身体有创伤性；(2)影像学类，如结肠镜检查、软式乙状结肠镜、CT结肠成像、结肠钡剂灌肠等，此类方法具有的侵入性、易产生并发症等缺陷限制了其在普查筛选中的应用；(3)粪便潜血检测类，如粪便隐血试验、粪便免疫化学试验等，方便无创但特异性敏感性不强，且不同方法学的检测结果一致性较差；(4)肿瘤标记物检测类，阳性率低，同样缺乏特异性。

近年来基因检测技术高速发展，对结直肠癌易感基因及突变位点进行检测，得到其具体的基因序列信息，对于实现结直肠癌的早期诊断、风险评估及指导结直肠癌病人临床用药具有重要的参考价值。美国《国家综合癌症网络(NCCN)结直肠癌临床实践指南》(2014年，第2版)指出，所有转移性结直肠癌患者都应进行肿瘤KRAS基因突变检测，对于KRAS野生型的患者应进行BRAF基因突变检测；携带KRAS突变基因的患者不能使用西妥昔单抗或帕尼单抗。

目前常用的基因突变检测方法主要是直接测序法与ARMS-PCR法。ARMS法可同时检测肿瘤组织中多种已知的常见突变，具有灵敏度高(可测出低至1％水平的突变)，操作简单，检测快速等优点；然而对于取样方便的血液样本如循环肿瘤细胞，肿瘤DNA含量过低，ARMS-PCR法不足以对其进行检测，同时该类试剂盒检测成本过高限制了在临床上的推广及应用。直接测序法是基因突变及多样性检测的金标准，具有技术成熟、结果准确和全面等优点，相比ARMS法检测费用低廉并且还能测出未知突变；而目前直接测序法主要的不足在于操作复杂，且检测灵敏度过低，只有突变达到大于10％甚至20％才能被可靠检出，不适合在临床中的应用与大量的临床样本分析。

新一代高通量测序(NGS)技术具有很高的敏感性和特异性，随着该技术的成熟及测序成本的持续降低，使用NGS技术进行结直肠癌易感基因突变检测具有广阔的应用前景。

发明内容

本发明目的之一在于提供检测结直肠癌易感基因突变的试剂盒，该试剂盒特异性强且灵敏度高；本发明的目的之二在于提供检测结直肠癌易感基因突变方法，该方法操作简单、检测周期短。

为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：

1.提供一组检测结直肠癌易感基因突变的引物，所述的通用引物核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；

用于扩增PIK3CA基因突变位点的特异性引物核苷酸序列如SEQ ID NO.3～6所示；

用于扩增BRAF基因突变位点的特异性引物核苷酸序列如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示；

用于扩增KRAS基因突变位点的特异性引物核苷酸序列如SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示。

2.提供一种结直肠癌易感基因突变位点检测试剂盒，主要成分如下：

3.提供一种结直肠癌易感基因突变位点检测的多重PCR体系：

4.提供一种结直肠癌易感基因突变位点检测方法，包括以下步骤：

A.抽提待测样品基因组DNA。

B.多重PCR法扩增待测样本基因组DNA的目标区域：

1)准备无菌、无核酸酶的200μL PCR管，置于冰上。

2)配制多重PCR体系，轻轻吹打混匀，离心后将管子置于冰上。3)将管子置于PCR仪中，按以下程序运行：

C.使用磁珠纯化文库。

D.对得到的文库质检后进行高通量测序并分析结直肠癌易感基因突变情况。