[发明专利]副溶血性弧菌指纹图谱库的制备方法

权利要求书

1.一种用作质谱鉴定副溶血性弧菌分型的多重PCR产物的副溶血性弧菌指纹图谱库的制备方法，包括如下步骤：

(1)合成副溶血性弧菌DNA片段保守序列的质粒，并设计其对应的特异性引物；

其中，保守序列分别选自如SEQ ID NO.7所示的副溶血性弧菌DNA的tlh片段、如SEQ IDNO.8所示的tdh片段、如SEQ ID NO.9所示的trh片段，所述片段的特异性引物对序列分别选自：SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2，SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4，SEQ ID NO.5和SEQ IDNO.6；

(2)用步骤(1)中的引物对组合对基因组DNA进行多重扩增；

(3)对PCR产物进行检测，检查PCR扩增质量；

(4)使用DNA吸附柱对多重PCR产物进行纯化；

(5)纯化产物与基质形成结晶混合物，点样于芯片上；

(6)通过MALDI TOF质谱仪检测，得到不同副溶血性弧菌的特征核酸指纹图谱；

(7)将步骤(6)得到的不同分离株的核酸指纹特征图谱，通过计算机软件进行汇总和整理，得到副溶血性弧菌的标准核酸指纹特征图谱。

2.权利要求1的制备方法，其中PCR反应所扩增的细菌核酸序列，选自副溶血性弧菌DNA基因组上一个区域。

3.权利要求1或2的方法，其中所述DNA吸附柱的固相支持物选自凝胶、树脂、硅土、硅胶、磁珠、玻璃粉或玻璃珠。

4.权利要求3的方法，其中所述基质为含有酸性成分的复合基质，该酸性成分选自甲酸、乙酸和柠檬酸。

5.权利要求1或2的方法，其中所述芯片为飞行时间质谱专用微阵列芯片，其材质选自不锈钢、金刚石、单晶硅、石英晶体。

6.权利要求5的方法，其中所述质谱仪为MALDI TOF MS质谱仪。

7.权利要求6的方法，其中所述副溶血性弧菌选自O1群和O139群。

8.权利要求7的方法，其中所述软件是BioExplore软件，其版权号为软著登字第136879号，登记号2009SR10700。