[发明专利]副溶血性弧菌指纹图谱库的制备方法

说明书

本发明公开了一种副溶血性弧菌指纹图谱库的制备方法，包括：设计保守序列对应的特异性引物；对基因组DNA进行多重扩增；对多重PCR产物进行纯化；纯化产物通过质谱仪检测，得到不同副溶血性弧菌的特征核酸指纹图谱；将步骤得到的不同分离株的核酸指纹特征图谱，通过计算机软件进行汇总和整理，得到副溶血性弧菌的标准核酸指纹特征图谱。基于该方法，建立常见副溶血性弧菌的核酸指纹图谱数据库，可对环境卫生、食品安全检测、公共场所安全、进出口检验检疫等领域的副溶血性弧菌分型进行鉴定，以维护公共卫生安全。

技术领域

本发明属于分子生物学检测领域，涉及一种利用飞行时间质谱技术快速鉴定副溶血性弧菌指纹图谱库的制备方法。

背景技术

副溶血性弧菌(Vibrio Parahemolyticus)分布极广，主要分布在海水和水产品中，我国华东地区沿岸的海水的副溶血性弧菌检出率为47.5％～66.5％，海产鱼虾的平均带菌率为45.6％～48.7％，夏季可高达90％以上。此外，畜禽肉、咸菜、咸蛋、淡水鱼等都发现有副溶血性弧菌的存在。副溶血性弧菌对人类危害仅次于霍乱弧菌，致病菌株可引起人类腹泻、恶心、呕吐、腹部痉挛，严重的可以引起昏迷、脱水甚至死亡。除了临床上需要加强副溶血性弧菌的检测之外，在食品安全(如肉制品加工、烧烤店)、环境卫生(如学校机关的后勤场所)、进出口检验检疫、公共场所安全方面也需要对副溶血性弧菌进行分型鉴定，以维护公共卫生安全。

研究发现副溶血性弧菌的主要毒力因子包括多种溶血毒素，主要有不耐热直接溶血毒素(TLH)、耐热直接溶血毒素(TDH)与耐热直接溶血相关毒素(TRH)，分别由tlh、tdh和trh基因编码。通常副溶血性弧菌的鉴定方法是分离培养、镜检观察、生化鉴定、嗜盐性试验等，不仅耗时，且操作复杂，灵敏度有限。近年来随着分子生物学的发展，对副溶血性弧菌的研究更深入了一步，尤其是对其基因组DNA、质粒、鞭毛以及致病因子等方面的研究更是取得了长足的进展。因此需要采用分子分型技术作为辅助诊断的方法。近年来常用的副溶血性弧菌快速检测方法主要有ELISA、DNA探针、常规PCR、实时PCR等。以多重PCR为基础的核酸检测方法，对副溶血性弧菌的准确鉴定和传染源的快速发现具有重要意义。且多重PCR检测针对多个基因，假阴性率比单重PCR降低。

基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry，简称MALDI-TOF MS)技术，是20世纪80年代末问世并迅速发展起来的一种质谱分析技术。其质量分析器是一个离子漂移管(iondirft tube)，由离子源产生的离子首先被收集，在收集器中所有离子速度变为0，使用一个脉冲电场加速后进入无场漂移管，并以恒定速度飞向离子接收器，离子质量越大，到达接收器所用时间越长；离子质量越小，到达接收器所用时间越短。根据这一原理，可以把不同质量的离子按质荷比大小进行分离，准确检测多肽、蛋白质、核酸、多糖等生物大分子的分子质量和纯度，具有准确性高、灵活性强、通量大、检测周期短、性价比高的优点。

近年来，已经出现质谱技术来检测核酸和蛋白质领域，其中质谱技术应用于核酸检测领域的理论基础在于，组成遗传物质DNA的基本单元——四种核苷酸之间存在质量差异，如ddAMP、ddCMP、ddGMP、ddTMP的分子量依次为271.2Da、247.2Da、287.2Da、327.1Da(其中ddTMP是经过修饰的)，它们之间的最小分子量差异在16Da，完全可以通过质谱进行分辨。使用质谱能够对碱基突变或多态位点(SNP)、插入/缺失(InDel)、甲基化位点、基因定量、拷贝数变化(copy number variation，CNV)等多种DNA变化类型进行检测。