[发明专利]一种单细胞甲基化测序文库的构建方法及其应用

权利要求书

1.一种单细胞全基因组甲基化测序的文库构建方法，该方法包括如下步骤：

1)单细胞转化DNA的获得；

2)DNA的富集；

3)富集DNA的建库。

2.权利要求1所述的方法，其中步骤1)进一步包括如下步骤：①分离单个细胞或细胞核；②将单细胞或细胞核进行裂解，得到单细胞样本；③将未甲基化的胞嘧啶转化成尿嘧啶；④纯化产物DNA片段。

3.权利要求1所述的方法，其中步骤2)进一步包括如下步骤：⑤短片段富集合成反应；⑥磁珠纯化并去除单链引物；⑦酶连反应；⑧多重置换扩增(MDA)；⑨磁珠纯化。

4.权利要求1所述的方法，其中步骤3)进一步包括如下步骤：⑩扩增产物浓度测定；基于Tn5的DNA测序文库的构建；文库纯化与片段分选。

5.权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的单细胞来源于植物、微生物或动物。

6.权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的单细胞来源优选植物。

7.权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的植物优选玉米。

8.权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的步骤①中以27％的山梨醇溶液平衡胞内渗透压，维持正常的细胞形态。

9.权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的步骤⑤用不含标签的随机序列作为引物。

10.权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的步骤⑦为利用高温将配对双链变性，再将单链小片段连接成单链长片段。

11.权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的步骤⑧将MDA的扩增方法引入了重亚硫酸盐测序的检测方法。

12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，所述的MDA扩增方法利用不含标签的5’末端生物素修饰的随机序列作为引物。

13.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，所述的MDA扩增试剂混匀后需要30℃孵育2.5小时。

14.权利要求3所述的步骤，其特征在于，所述的步骤⑤和步骤⑧所用引物序列的碱基数目优选9个。

15.权利要求1所述的方法在单细胞甲基化检测中的应用。

16.权利要求1所述的方法在甲基化测序试剂盒构建中的应用。