[发明专利]一种单细胞甲基化测序文库的构建方法及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及基因检测领域。具体地说，涉及一种单细胞全基因组甲基化测序文库的构建方法及其应用。

背景技术

DNA甲基化是基因组DNA的一种重要表观遗传方式，是在DNA甲基转移酶(DNA methyltransferase，DNMT)的催化下，以S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine，SAM)为甲基供体，将甲基转移到特定的碱基上的过程。DNA甲基化现象广泛存在于细菌、植物和动物中，参与生物体的多种生物学过程(Law J A and Jacobsen S E，Establishing，maintaining and modifying DNA methylation patterns in plants and animals[J].Nat Rev Genet，2010.11(3)：204-220.)。在植物中，DNA甲基化具有物种、组织、器官、细胞、发育阶段等时空特异性，在植物生长发育、适应环境条件以及进化过程中起着重要的调节作用(Fujimoto R，Sasaki T，Kudoh H，et al.，Epigenetic variation in the FWA gene within the genus Arabidopsis[J].Plant J，2011.66(5)：831-843.)。

表观遗传学的研究现已成为热点，用于检测DNA甲基化的方法也随之不断涌现。常用检测方法包括基于凝胶分析方法、基于基因芯片分析、基于高通量测序方法、高效液相色谱柱(high performance liquid chromatography，HPLC)、甲基化敏感性限制性内切酶(MS-RE)-PCR/Southern法、结合亚硫酸氢盐的限制性内切酶法(combined bisulfite restriction analysis，COBRA)、甲基化荧光检测(methylight)、限制性标记基因组扫描(restriction landmark genomic scanning，RLGS)和MBD柱层析与MS-RE联用技术(combination of methylated-DNA precipitation and methylation-sensitive restriction enzymes，COMPARE-MS)等。目前已报道的单细胞DNA甲基化测序的方法有两种：一种是单细胞简化代表性重亚硫酸盐测序(single-cell reduced-representation bisulfite sequencing，scRRBS)(Guo H，Zhu P，Wu X，et al.，Single-cell methylome landscapes of mouse embryonic stem cells and early embryos analyzed using reduced representation bisulfite sequencing[J].Genome Res，2013.23(12)：2126-2135.)和单细胞重亚硫酸盐测序(single-cell bisulfite sequencing，scBS)(Smallwood S A，Lee H J，Angermueller C，et al.，Single-cell genome-wide bisulfite sequencing for assessing epigenetic heterogeneity[J].Nat Methods，2014.11(8)：817-820.)。scRRBS是第一个发明出来的单细胞甲基化测序方法。该方法采用先酶切CG位点再重亚硫酸盐转换并富集扩增的策略，仅能低覆盖率地检测GC酶切位点附近的甲基化；植物中由于存在大量的CHG和CHH甲基化类型，所以scRRBS并不适合植物中的分析。scBS操作原理是先对基因组进行重亚硫酸盐转换、片段化，然后再用随机引物对小片段进行两步扩增，能获得相比scRRBS更大的覆盖度及更无偏的甲基化位点信息，但亚硫酸盐转换产生的小片段的长度直接影响了文库的覆盖度(过长和过短的片段都无法进行测序)。