[发明专利]一种凡纳滨对虾C239T单核苷酸多态性标记候选序列的筛选方法

说明书

本发明公开的是一种凡纳滨对虾C239T单核苷酸多态性标记序列的筛选方法，包括以下步骤：（1）筛选候选序列（2）筛选候选SNP位点（3）设计特异性引物。本发明可以在没有已知的凡纳滨对虾基因组DNA单核苷酸多态性位点的信息下，通过转录组混合样测序，筛选出候选序列及候选SNP位点，为凡纳滨对虾C239T单核苷酸多态性标记的筛选及检测打下基础，在这个基础上利用生物信息学分析筛选C239T单核苷酸多态性位点；并采用PAMSA（PCR amplification of multiple specific alleles）方法设计特异性引物，不仅可便捷的通过聚丙酰胺凝胶电泳完成凡纳滨对虾C239T单核苷酸多态性检测、验证及基因分型，而且筛选检测费用低、操作简便快速。

技术领域

本发明属于凡纳滨对虾DNA分子遗传标记技术，涉及的是一种凡纳滨对虾C239T单核苷酸多态性标记序列的筛选方法。

背景技术

凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)是对虾属种世界养殖产量最高的物种，俗称南美白对虾(White pacific shrimp)，其原产于中南美洲沿岸海域，我国早在1988年就从美国夏威夷引种并开展人工育苗的研究。由于凡纳滨对虾对白斑病毒(WSSV)具有较好的抵抗力，所以2000年后我国的凡纳滨对虾产量呈爆发式增长，在2016年我国的养殖总产量已达93万吨，占对虾养殖总产量的73％以上，是我国最重要对虾养殖品种。在我国，伴随着凡纳滨对虾产业的快速发展，对苗种的需求逐年增长，海外进口亲虾和虾苗已经无法满足日益增长的需求了，开展凡纳滨对虾的遗传改良和品种选育，开发自主知识产权的品种迫在眉睫。目前我国凡纳滨对虾的遗传选育还是以传统选育为主，采用家系选育策略，结合家系内个体选择开展性状改良工作，其改良周期需累积多个选育世代。为了弥补传统选育成本高，耗时长，工作量大的缺点，研究人员提出采用分子标记辅助育种，全基因选择育种等技术提高凡纳滨对虾性状选育效率。然而，由于凡纳滨对虾全基因DNA信息尚未完成公开发布，与大西洋鲑鱼等海水养殖鱼类相比，目前凡纳滨对虾分子标记开发的数量和质量还不能满足其分子育种的需求。

作为新一代的DNA分子标记，单核苷酸多态性标记是基因组中含量最丰富的分子标记，并且遗传稳定性高、分型准确，易于实现高通量、自动化的检测，是当前凡纳滨对虾选育群体遗传背景调查、个体选育、家系系谱鉴定和高密度遗传连锁图谱构建的首选DNA分子标记之一。但凡纳滨对虾全基因组DNA信息匮乏，有关其单核苷酸多态性标记开发、应用的研究报道不多。Yu等人报道了凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)的SNP标记筛选和检测，所采用的分型方法是常规的Sangerc测序分型。该方法SNP标记检测和应用的成本较高。而凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)的SNP标记筛选的检测分型的过程中，最关键的是凡纳滨对虾单核苷酸多态性标记候选序列的筛选方法和候选SNP位点筛选方法，筛选出了多态性标记候选序列及候选SNP位点，就可以实现对凡纳滨对虾单核苷酸多态性标记的筛选及检测，从而实现对凡纳滨对虾单核苷酸多态性标记验证及基因分型，有利于斑节虾系谱鉴定、遗传连锁图谱构建等研究开展。

发明内容

本发明的目的在于提供一种凡纳滨对虾C239T单核苷酸多态性标记序列的筛选方法,在凡纳滨对虾基因组DNA信息匮乏的背景下,实现对凡纳滨对虾单核苷酸多态性标记的筛选及检测，从而实现对凡纳滨对虾单核苷酸多态性标记验证及基因分型，为凡纳滨对虾育种项目中的遗传背景调查和家系系谱鉴定服务。

为实现上述目的,本发明采取了下述技术方案,一种凡纳滨对虾C239T单核苷酸多态性标记序列的筛选方法，包括下述具体技术步骤：

(1)筛选候选序列：提取15个凡纳滨对虾个体的头胸甲总RNA，混合样品进行转录组测序，拼接凡纳滨对虾头胸甲参考转录本，比对定位测序读端(reads)到参考转录本筛查单核苷酸多态性位点，并筛选比对质量分数大于40、次要等位基因频数在200以上，及次要等位基因频率高于20％的位点为候选序列；

(2)筛选候选SNP位点：