[发明专利]一种鉴定橄榄油掺杂的检测方法

权利要求书

1.一种鉴定橄榄油掺杂的检测方法，其特征在于：包括以下步骤：

步骤一、引物设计：针对NCBI库中棕榈脂肪酸合成的基因设计并筛选：

针对橄榄油，筛选出第一引物对GL1及第二引物对GL2,所述第一引物对GL1包括上游引物GL1F及下游引物GL1R, 所述第二引物对GL2包括上游引物GL2F及下游引物GL2R，所述GL1F、GL1R、GL2F、GL2R的核苷酸碱基序列分别如序列表SEQ NO:1至SEQ NO:4所示；

针对目标检测物，筛选出第一引物对EO1及第二引物对EO2,所述第一引物对EO1及第二引物对EO2根据实际目标检测物的NCBI库中棕榈脂肪酸合成的基因设计并筛选得到；

作为实时荧光定量PCR的内参，采用引物对TY2，所述引物对TY2包括上游引物TY2F及下游引物TY2R，所述TY2F及所述TY2R的核苷酸碱基序列分别如序列表SEQ NO:5及SEQ NO:6所示；

步骤二、待检测橄榄油的DNA提取：采用质粒抽提试剂盒提取，得到待检测DNA油样；

步骤三、实时荧光定量PCR反应：在所述待检测DNA油样中加入引物对GL1、GL2、EO1、EO2及TY2进行扩增，以在40个循环内是否读取到Ct值为标准，判断是否得到阳性扩增，据此判断橄榄油是否掺杂。

2.如权利要求1所述的一种鉴定橄榄油掺杂的检测方法，其特征在于：所述步骤一中，所述目标检测物为棕榈油，所述第一引物对EO1包括上游引物EO1F及下游引物EO1R，所述第二引物对EO2包括上游引物EO2F及EO2R，所述EO1F、所述EO1R、所述EO2F及所述EO2R的核苷酸碱基序列分别如序列表SEQ NO:7至SEQ NO:10所示。

3.如权利要求1所述的一种鉴定橄榄油掺杂的检测方法，其特征在于：所述步骤二的具体步骤为，取两支50ml的试管，每管各加入悬浮液6.5ml和裂解液6.5ml，并加入待检测样品至50ml，颠倒混匀震荡10min，10000r/min离心2min，去油相，在水相中加入橄榄油至50ml，重复上述动作4次；在两支试管中第4次离心后保留的水相中加入13ml试剂盒中的结合液随即上下颠倒6次，10000r/min离心20min，然后按照试剂盒后续操作说明进行，合并两支试管的DNA油样，制得待检测DNA油样，最后将待检测DNA油样存于-20℃中。

4.如权利要求1所述的一种鉴定橄榄油掺杂的检测方法，其特征在于：所述步骤二的质粒抽提试剂盒采用上海碧云天生物技术有限公司生产的质粒抽提试剂盒D0026。

5.如权利要求1所述的一种鉴定橄榄油掺杂的检测方法，其特征在于：所述实时荧光定量PCR的扩增参数如下：扩增反应体积为20ul，ROX I 0.25ul，2X Syker Mix 10ul，浓度为10umol/L的引物 0.4ul，ddH₂O 7.35ul，DNA模板 2.0ul；扩增反应条件：95℃ 5min，95℃ 5s，60℃ 31s，循环数40。

6.如权利要求1所述的一种鉴定橄榄油掺杂的检测方法，其特征在于：还包括实时荧光定量PCR标准曲线的绘制：即采用已知拷贝数的橄榄油及目标检测物作为标准样品；扩增后，测定各油样中相关荧光标记物的Ct值，该Ct值与拷贝数的自然对数呈线性关系，据此绘制SYBR Green I实时荧光定量PCR标准曲线。