[发明专利]一种鉴定橄榄油掺杂的检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物检测的技术领域，尤其涉及一种鉴定橄榄油掺杂的检测方法。

背景技术

橄榄油以其独特的理化特性和营养价值越来越受到人们的青睐，其不饱和脂肪酸高达82％-87％，油酸、亚油酸、亚麻油酸含量的比例是最适合人体需要的比例。橄榄油具有抗氧化、预防癌症、美容等功效，价格比其他植物油要高得多。然而一些不法商家为牟取暴利，便在高价的橄榄油中掺入低价的植物油或者其他初榨橄榄油及橄榄油果渣等。这种掺假油单从颜色、气味等外观上很难进行辨别真伪，严重损害了消费者的健康和权益。意大利多品牌高端橄榄油被爆掺入廉价橄榄油；台湾地区“味全”品牌被查出掺入果渣油以及台湾地区“地沟油”事件，不断爆出的食用植物油掺假事件引起了人们对植物油安全质量的广泛关注。因此，为保障消费者的权益和健康，开发一种橄榄油真伪的鉴定方法，对控制食品质量安全和杜绝橄榄油掺假事件有着重要意义。

各国都十分关注橄榄油掺假事件，对此建立了大量的分析方法。近年来，橄榄油掺杂的鉴定技术主要有原子转换质谱、核磁共振、光谱分析、高效液相色谱及其他方法。然而，由于橄榄油的化学组成成分随着生长季节及环境的变化而变化，通过理化方法无法准确鉴别橄榄油真伪。由于精炼食用植物油经过脱胶、脱酸、脱色等复杂的加工过程，其核酸遭到严重的破坏，含量非常低，再加上植物油的主要成分是脂类物质，水溶性的DNA含量相当少且质量差。提取时经常会遇到提不到DNA或是提到少量DNA但却扩增不出来的各种情况。因此，提取橄榄油中DAN的重点在于如何有效、方便的富集和提取橄榄油中DNA。橄榄油中残留的微量核酸说明代表物种特异性的基因可能被保留下来，不同物种其遗传性质都有不同的特异性，可通过检验其特异性基因来鉴别物种。因此基于DNA分析的分子生物学方法为鉴定橄榄油掺杂的检测提供了有力保障。

有鉴于此，本发明人研究和设计了一种鉴定橄榄油掺杂的检测方法，本案由此产生。

发明内容

本发明的目的在于提供一种鉴定橄榄油掺杂的检测方法。

为了实现上述目的，本发明解决其技术问题所采取的技术方案是：

一种鉴定橄榄油掺杂的检测方法，包括以下步骤：

步骤一、引物设计：针对NCBI库中棕榈脂肪酸合成的基因设计并筛选：

针对橄榄油，筛选出第一引物对GL1及第二引物对GL2,所述第一引物对GL1包括上游引物GL1F及下游引物GL1R, 所述第二引物对GL2包括上游引物GL2F及下游引物GL2R，所述GL1F、GL1R、GL2F、GL2R的核苷酸碱基序列分别如序列表SEQ NO:1至SEQ NO:4所示；

针对目标检测物，筛选出第一引物对EO1及第二引物对EO2,所述第一引物对EO1及第二引物对EO2根据实际目标检测物的NCBI库中棕榈脂肪酸合成的基因设计并筛选得到；

作为实时荧光定量PCR的内参，采用引物对TY2，所述引物对TY2包括上游引物TY2F及下游引物TY2R，所述TY2F及所述TY2R的核苷酸碱基序列分别如序列表SEQ NO:5及SEQ NO:6所示；

步骤二、待检测橄榄油的DNA提取：采用质粒抽提试剂盒提取，得到待检测DNA油样；

作为实施例的优选方式，所述质粒抽提试剂盒采用上海碧云天生物技术有限公司生产销售的质粒抽提试剂盒D0026。

步骤三、实时荧光定量PCR反应：在所述待检测DNA油样中加入引物对GL1、GL2、EO1、EO2及TY2进行扩增，以在40个循环内是否读取到Ct值为标准，判断是否得到阳性扩增，据此判断橄榄油是否掺杂。

作为实施例的优选方式，所述步骤一中，所述目标检测物为棕榈油，所述第一引物对EO1包括上游引物EO1F及下游引物EO1R，所述第二引物对EO2包括上游引物EO2F及EO2R，所述EO1F、所述EO1R、所述EO2F及所述EO2R的核苷酸碱基序列分别如序列表SEQ NO:7至SEQ NO:10所示。

作为实施例的优选方式，所述步骤二的具体步骤为，取两支50ml的试管，每管各加入悬浮液6.5ml和裂解液6.5ml，并加入待检测样品至50ml，颠倒混匀震荡10min，10000r/min离心2min，去油相，在水相中加入橄榄油至50ml，重复上述动作4次；在两支试管中第4次离心后保留的水相中加入13ml试剂盒中的结合液随即上下颠倒6次，10000r/min离心20min，然后按照试剂盒后续操作说明进行，合并两支试管的DNA油样，制得待检测DNA油样，最后将待检测DNA油样存于-20℃中。