[发明专利]一种绵羊卵母细胞体外“双阶段”成熟方法及其预孵育液和试剂盒

权利要求书

1.一种绵羊小卵泡卵母细胞体外“双阶段”成熟方法，包括：采用用于绵羊卵母细胞体外成熟的试剂盒对待处理细胞进行预孵育和体外成熟培养；所述用于绵羊卵母细胞体外成熟的试剂盒包括预孵育液和用于绵羊卵母细胞体外成熟的常规试剂；所述预孵育液为添加了终浓度为150 nM -200 nM的C-型钠肽和终浓度为0.5 mg/ml -1.0 mg/ml的聚乙烯吡咯烷酮的卵母细胞体外基础培养基TCM199；

所述预孵育包括：将所述待处理细胞置于所述预孵育液中培养4h；所述体外成熟培养时间为26h，培养条件为：培养环境为38.5℃，5% CO2：95% 空气、饱和湿度；

所述绵羊小卵泡卵母细胞为卵泡直径3 .0mm小卵泡中的卵母细胞。

2.根据权利要求1所述的一种绵羊小卵泡卵母细胞体外“双阶段”成熟方法，其特征在于，所述C-型钠肽在所述卵母细胞体外基础培养基TCM199中的终浓度选自下述浓度之一：150 nM、160 nM、170 nM、180 nM、190 nM、或200 nM；

所述聚乙烯吡咯烷酮在所述卵母细胞体外基础培养基TCM199中的终浓度选自下述浓度之一：0.5 mg/ml、0.6 mg/ml、0.7 mg/ml、0.8 mg/ml、0.9 mg/ml、1.0 mg/ml。

3.根据权利要求1所述的一种绵羊小卵泡卵母细胞体外“双阶段”成熟方法，其特征在于，所述常规试剂为促成熟合剂；所述促成熟合剂包括体积比为20% 的FBS，0.2 IU/ml 的FSH，和0.1 IU/ml LH。

4.根据权利要求1所述的一种绵羊小卵泡卵母细胞体外“双阶段”成熟方法，其特征在于，所述常规试剂还可以是常规体外成熟液；所述常规体外成熟液包括：TCM199、体积比为10%的FBS、0.05IU/ml FSH、0.05IU/ml LH、1ug/ml E₂、100 U /mL 青霉素、和100 U /mL 链霉素。

5.根据权利要求1所述的一种绵羊小卵泡卵母细胞体外“双阶段”成熟方法，其中，所述预孵育还包括：在进行所述培养4h之前，用所述预孵育液将所述待处理细胞清洗3次。

6.根据权利要求5所述的一种绵羊小卵泡卵母细胞体外“双阶段”成熟方法，所述预孵育还包括：在进行所述培养4h之前，所述预孵育液预先在CO₂培养箱中平衡2h以上。

7.根据权利要求5所述的一种绵羊小卵泡卵母细胞体外“双阶段”成熟方法，其特征在于，所述培养4h的培养条件为含5% CO₂的空气，温度38.6℃，饱和湿度。

8.根据权利要求1-3、5-7任一所述的一种绵羊小卵泡卵母细胞体外“双阶段”成熟方法，其特征在于，还包括：在进行所述预孵育后，直接添加促成熟合剂进行体外成熟培养。

9.根据权利要求8所述的一种绵羊小卵泡卵母细胞体外“双阶段”成熟方法，其特征在于，所述促成熟合剂在添加前预先在CO₂培养箱中平衡2 h以上。

10.根据权利要求1所述的一种绵羊小卵泡卵母细胞体外“双阶段”成熟方法，其特征在于，所述待处理细胞指胞质均匀、卵丘细胞比较完整的卵丘卵母细胞复合体。