[发明专利]一种绵羊卵母细胞体外“双阶段”成熟方法及其预孵育液和试剂盒

说明书

本发明“一种绵羊卵母细胞体外“双阶段”成熟方法及其预孵育液和试剂盒”，属于胚胎工程领域。所示预孵育液包括添加了C‑型钠肽和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)的卵母细胞体外基础培养基TCM199。因此，本发明提供的C‑型钠肽预孵结合体外成熟的“双阶段”培养体系能够有效地促进绵羊卵母细胞核质同步成熟并提高卵母细胞体外发育能力，能够为绵羊体外胚胎生产提供优质的卵源和胚胎，更好的满足科研与生产的需要。

技术领域

本发明涉及胚胎工程领域，具体涉及一种绵羊卵母细胞体外“双阶段”成熟方法及其预孵育液和试剂盒。

背景技术

绵羊卵母细胞体外成熟质量是影响体外受精、体外胚胎发育的一个关键因素，也是制约胚胎移植、胚胎干细胞以及转基因动物来源的主导因素，因此研究改善卵母细胞体外成熟体系成为提高卵母细胞质量的突破口。卵母细胞体外成熟历经一个多阶段、复杂、不连续的过程，涉及细胞核成熟、细胞质成熟以及颗粒细胞与卵母细胞相互作用的过程。

一直以来，研究者们都在尝试模拟卵母细胞生存和发育的生理内环境，改善卵母细胞体外成熟体系，为生产和科研提供优质卵源，进而提高胚胎体外生产效率。2008年，杨志杰等研究了在绵羊卵巢卵母细胞体外成熟基础培养液中添加不同浓度FCS对绵羊卵巢卵母细胞体外成熟培养及体外胚胎发育的影响，结果发现，在基础培养液中添加FCS可以显著提高卵母细胞的体外成熟率，而添加不同比例（10%、15%和20%）FCS对卵母细胞的成熟率的影响差异不显著。同时比较了体外不同的培养时间对绵羊卵母细胞的成熟的影响，并发现绵羊卵母细胞体外培养24 h和26 h成熟率(分别为73.3%和77.5%)显著高于体外培养18 h和20 h的卵母细胞成熟率(分别为62.5%和65.0%)，确定体外成熟的培养时间以24~26 h最佳。（杨志杰等.培养条件对绵羊卵巢卵母细胞体外成熟及受精的影响[J]. 甘肃农业大学学报，2008）。2010年，郭延华研究了在绵羊卵母细胞成熟液和胚胎发育液中添加100 ng/mlEGF，并通过比较极体排出率、胚胎发育能力及囊胚细胞数，结果发现，EGF对绵羊卵母细胞体外成熟和胚胎发育都有积极的影响。（郭延华. EGF对不同直径卵泡绵羊卵母细胞体外成熟、受精及胚胎发育的影响[J]. 石河子大学2010）。

张美佳等同年研究发现，小鼠的卵泡壁层颗粒细胞产生的生理性旁分泌因子C-型钠肽（C-type natriuretic peptide，CNP）通过作用于卵母细胞周围的卵丘颗粒细胞的G蛋白偶联受体NPR2 (NPPC receptor 2, NPR2)，其受体NPR2主要在卵丘颗粒细胞上表达，激活鸟苷酸环化酶（guanosinecyclase, GC），引起cGMP合成量增加，cGMP通过卵丘细胞与卵母细胞之间的间隙连接转运至卵母细胞内抑制磷酸二酯酶3A（phosphodiesterase 3A，PDE3A）的活性，维持卵母细胞高水平的cAMP从而抑制卵母细胞减数分裂的恢复（MeijiaZhang, You-Qiang Su, Koji Sugiura, Guoliang Xia, and John J. Eppig. GranulosaCell Ligand NPPC and Its Receptor NPR2 Maintain Meiotic Arrest in MouseOocytes. Science. 2010）。2014年日本学者Hiradate等人在猪的卵丘卵母细胞复合体体外培养过程中，同样发现CNP抑制卵母细胞核减数分裂恢复过程中发挥了重要作用（Hiradate Y, Hoshino Y, Tanemura K, Sato E. C-type natriuretic peptideinhibits porcine oocyte meiotic resumption. Zygote. 2014）。然而，CNP对绵羊卵母细胞的影响和应用仍然未知。