[发明专利]一种减少CD8+T细胞凋亡并增强其功能的培养方法

权利要求书

1.一种减少CD8⁺T细胞凋亡并增强其功能的培养方法，其特征在于，该方法通过HMGB1的应用，降低CD8⁺T细胞表面的PD-1的表达，同时降低T细胞的凋亡，进而增强T细胞杀伤肿瘤的功能效果；

所述HMGB1，为一种应激细胞分泌到细胞外的分泌蛋白；

所述CD8⁺T细胞，其初始来源为外周血来源的CD8⁺T细胞，或者为肺癌患者的肺癌组织来源的T细胞；

（一）针对外周血来源的CD8⁺T细胞，该培养方法具体包括如下步骤：

（1）采集外周血后，分离提取获得单个核细胞和自体血清，

（2）磁珠分选CD8⁺ T细胞，具体利用CD8磁珠分选获得CD8⁺T 细胞；

（3）体外细胞培养，具体为：

第0天：将步骤（二）所获CD8⁺ T细胞平铺于孔板中，加入淋巴细胞培养基；

然后加入A试剂，加入量为10μL/mL，再按淋巴细胞培养基体积比10%比例加入自体血清进行培养；

所述A试剂为溶解有IL-2和CD3/CD28 Dynabeads的GT-T551无血清培养基，IL-2的浓度为10U/μL，CD3/CD28 Dynabeads的浓度为2×10⁵ beads/μL；

第3天：加入B试剂，加入量为10μL/mL，按体积比半量方式换液加入淋巴细胞培养基及其初体积10%比例自体血清；

所述B试剂为溶解有IL-2的GT-T551无血清培养基，IL-2的浓度为10U/μL；

保持B试剂终浓度为10μL/mL进行扩增培养；

扩增后，加入C试剂，加入量为10μL/mL，并加入淋巴细胞培养基及其初体积10%比例自体血清，继续培养；

所述C试剂为溶解有IL-2和重组蛋白HMGB1的GT-T551无血清培养基，其中IL-2的浓度为10U/μL，重组蛋白HMGB1的浓度为5～20 ng/μL；

培养结束后，收集细胞，检测细胞免疫表型、杀伤功能及细胞凋亡，从而对培养结果做出准确评价；

（二）针对肺癌患者的肺癌组织来源的T细胞进行培养时，直接参考前述“体外细胞培养”相关操作，对T细胞进行适当扩增培养后，直接采用含HMGB1的C试剂进行处理培养即可。

2.如权利要求1所述减少CD8⁺T细胞凋亡并增强其功能的培养方法，其特征在于，步骤（一）中，具体处理方式如下：

采集5mL外周血，1500 rpm/min 离心10 min后，分离沉淀细胞和上清液，将上清液灭活后 -20℃保存备用；

将沉淀细胞用30mL生理盐水重悬后置于15mL淋巴细胞分离液上，进行密度梯度离心，收集单个核细胞并用生理盐水洗三次；所述密度梯度离心，具体参数为：2500 rpm/min离心25min。

3.如权利要求1所述减少CD8⁺T细胞凋亡并增强其功能的培养方法，其特征在于，步骤（二）中，CD8磁珠分选时，按20μL /10⁷cell量加入CD8磁珠。

4.如权利要求1所述减少CD8⁺T细胞凋亡并增强其功能的培养方法，其特征在于，步骤（三）中，第0天培养时，所述淋巴细胞培养基为GT-T551无血清培养基。

5.如权利要求1所述减少CD8⁺T细胞凋亡并增强其功能的培养方法，其特征在于，步骤（三）中，C试剂中重组蛋白HMGB1的浓度为10 ng/μL。