[发明专利]一种减少CD8+T细胞凋亡并增强其功能的培养方法

说明书

本发明属于肿瘤预防和治疗技术领域，具体涉及一种优化的T细胞的培养方法。该方法通过HMGB1的应用，降低CD8⁺T细胞表面的PD‑1的表达，同时降低T细胞的凋亡，进而增强T细胞杀伤肿瘤的功能效果。本申请通过优化T细胞的培养体系，结合采用肿瘤微环境中应激性细胞释放的高迁移率族蛋白B1（HMGB1）的处理，有效降低了CD8⁺T细胞表面PD‑1的表达，进而使得T细胞的杀伤能力有了明显的改善，同时有效降低了细胞凋亡水平，最终使得生物免疫治疗技术能够更好的用于肿瘤治疗，对于延长病人生存质量和生存期具有较为重要的应用价值，同时由于相关处理方式较为成熟，因而具有较好的推广应用意义。

技术领域

本发明属于肿瘤预防和治疗技术领域，具体涉及一种优化的T细胞的培养方法。

背景技术

肺癌是中国乃至全球恶性程度非常高的肿瘤，在各类肿瘤中的发病率及死亡率一直位居第一，是威胁人类健康的头号杀手。攻克肺癌已成为刻不容缓的重要任务。因此，提高肿瘤免疫治疗的效果，延长肿瘤患者生存期具有十分重要的意义。

现有技术中，通过体外培养杀伤肿瘤细胞，进而通过过继性细胞免疫方式来增强患者免疫力、增强对肿瘤细胞的抑制杀伤力，是目前认为的最好的提升肿瘤患者生存质量的方法之一。在肿瘤免疫治疗方法中，由于T细胞功能更强、细胞生存时间更长，因此对肿瘤杀伤也就更有意义。也因此，体外T细胞培养方式、培养方法的效率、效果也是肿瘤免疫治疗技术中的关键和核心。

发明内容

现有技术中，CD8⁺T细胞功能容易受肿瘤微环境中免疫抑制性细胞释放的免疫抑制性细胞因子等的抑制性作用影响，进而影响相关肿瘤杀伤效果，针对这一缺陷，本申请目的在于提供一种上调CD8⁺T细胞功能的培养方法。

本申请的技术方案详述如下。

一种减少CD8+T细胞凋亡并增强其功能的培养方法，该方法的主要技术原理是：通过HMGB1的应用，降低CD8⁺T细胞表面的PD-1的表达，同时降低T细胞的凋亡，进而增强T细胞杀伤肿瘤的功能效果；

所述HMGB1，为一种应激细胞分泌到细胞外的分泌蛋白，优选采用重组蛋白HMGB1，从而便于获得和调节用量；

所述CD8⁺T细胞，其初始来源为外周血来源的CD8⁺T细胞（健康人体外周血或肺癌患者外周血均可），或者为肺癌患者的肺癌组织来源的T细胞；

以外周血来源的CD8⁺T细胞的培养为例，该培养方法具体包括如下步骤：

（一）采集外周血后，分离提取获得单个核细胞和自体血清，具体操作参考如下：

采集5mL外周血，1500 rpm/min 离心10 min后，分离沉淀细胞和上清液（即自体血清），将上清液灭活后 -20℃保存备用；

将沉淀细胞用30mL生理盐水重悬后置于15mL淋巴细胞分离液上，进行密度梯度离心，收集单个核细胞并用生理盐水洗三次；所述密度梯度离心，具体参数为：2500 rpm/min离心25min；

（二）磁珠分选CD8⁺ T细胞，具体如下：

（1）细胞计数

根据目的细胞（即CD8⁺ T细胞）在总细胞液中所占比例，以及最终需要的细胞量，计算出大致需要分选的细胞总数（即确定所需分选的细胞总量），根据此计算结果，选择对应量的步骤（一）中所收集的单个核细胞，使用Washing Buffer清洗，然后1500rpm离心10min，弃上清；

（2）磁珠孵育