[发明专利]一种pFTM3GW重组载体及其制备方法和应用

说明书

本发明提供了一种pFTM3GW重组载体及其制备方法和应用，所述pFTM3GW重组载体包括识别NY‑ESO‑1抗原的特异性T细胞受体和慢病毒载体pFTM3GW；其中，所述识别NY‑ESO‑1抗原的特异性T细胞受体顺次包括α链、弗林蛋白酶、SGSG柔性氨基酸、连接肽和β链；本发明通过将包括α链、弗林蛋白酶、SGSG柔性氨基酸、连接肽和β链的T细胞受体插入pFTM3GW载体中，各部件协同增效，促进T细胞受体α链和β链形成稳定结构并高效表达，促进信号转导，提高转染效率和靶向效果，促进免疫治疗效果，具有广阔的应用前景和市场价值。

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种pFTM3GW重组载体及其制备方法和应用。

背景技术

当今，过继性细胞免疫治疗已被公认为是继手术、化疗、放疗之后第四种有效治疗肿瘤的方法。其中，以T细胞为主的过继性细胞治疗通过增强机体免疫力来介导对肿瘤细胞的消除，是近年来获得较高关注的一种特异性、无毒性的癌症新疗法。肿瘤之所以能在体内增殖、转移，是因为缺少MHC抗原等能激活T细胞的分子，不能被T细胞识别，而无法激活T细胞介导的主动免疫。因此，要诱导强有力的抗肿瘤免疫应答，首先必须需要肿瘤相关抗原的表达和呈递以及共刺激分子和细胞因子介导的免疫作用。

T细胞受体(T cell receptor,TCR)作为T细胞识别和激发免疫效应的关键分子在以T细胞为主的肿瘤免疫应答中起着核心作用，TCR是T细胞表面特异性识别抗原和介导免疫应答的分子。TCR包括α、β、γ和δ四种肽链，由可变区(V区)、结合区(J区)、多样区(D区)和恒定区(C区)等基因片段组成，分别由二硫键连接形成α/β和γ/δ两种异二聚体，其中α/βT细胞占外周血细胞的90～95％，本专利主要研究以α/β二聚体基因修饰的TCR-T细胞。

TCR-T细胞：利用基因工程技术，通过将编码肿瘤特异性TCR的基因克隆并构建转基因载体转导T细胞，在体外产生大量的具有已知抗原特异性和功能亲和性的T细胞。

NY-ESO-1抗原优势：在众多肿瘤抗原家族中，癌-睾丸抗原(Cancer-testisAntigens，CTA)特异性强，广泛表达于肿瘤组织，大约有110种CTA可以被自体产生的T细胞或基因修饰后的T细胞识别。

NY-ESO-1抗原属于CTA家族，在多种肿瘤细胞中有表达包括黑色素瘤、食道癌、膀胱癌、乳腺癌、肝癌、肺癌、前列腺癌、卵巢癌等。但NY-ESO-1在除睾丸组织以外的正常组织不表达，睾丸组织不表达MHC I类及II类分子，所以不会被T细胞识别杀伤。正是由于这一特征，NY-ESO-1成为了肿瘤免疫治疗研究的热点。

CN105838738A公开了一种携带CTAG1B/NY-ESO-1肿瘤抗原基因的自补型重组腺相关病毒载体，其构建方法，包括以下步骤：(1)体外克隆CTAG1B/NY-ESO-1基因；(2)将pscAAV-MCS载体和克隆基因分别用限制性内切酶BamH I和Xba I进行双酶切，然后DNA连接得携带CTAG1B基因的重组载体pscAAV－CTAG1B；(3)测序鉴定。CN107502596A提供了一种含有特异性识别NY-ESO-1的T细胞受体和同时表达所述TCR和细胞因子的T细胞，构建了重组表达载体pGreen puro-TCR(NY-ESO-1)、包装并纯化慢病毒、慢病毒载体感染T淋巴细胞，但上述现有技术制备得到的TCR灵敏度低，信号转导较弱，感染效率不够高，制备方法复杂繁琐。

综上所述，目前T细胞受体(TCR)识别肿瘤抗原的灵敏度较低，信号转导较弱的情况，因此，研发一种重组载体以便用于表达大量NY-ESO-1特异性TCR，具有广阔的应用前景和巨大的市场价值。

发明内容

针对现有技术的不足及实际的需求，本发明提供一种pFTM3GW重组载体及其制备方法和应用，通过设计包含多组分的T细胞受体并插入特定载体中，提高了TCR的信号转导和转染效率，促进了免疫治疗效果。