[发明专利]一种单细胞RNA逆转录与文库构建的方法

权利要求书

1.一种单细胞mRNA逆转录同时构建cDNA文库的方法，包括：

1)裂解单细胞或极微量细胞获得总RNA；

2)使用逆转录接头和MM_6N引物在逆转录酶的作用下对mRNA进行逆转录获得cDNA第一链；

其中所述逆转录接头从5’端到3’端为：GCTCTTCCGATCTMM+poly(dT)+VN，5’端以SpacerC18修饰，其中V＝A或C或G；N＝A或C或G或T，且其中所述poly(dT)包含30个T碱基；

所述MM_6N引物为SEQ ID No.1所示，从5’端到3’端为：GCTCTTCCGATCTMM+NNNNNN，

其中NNNNNN为6碱基随机引物，用于和RNA随机贴合；

3)在获得的cDNA第一链的3’端不依赖模板添加2-5个C核苷酸；

4)使用步骤3)获得的cDNA为模板，使用模板转换寡核苷酸在逆转录酶的以DNA为模板的聚合活性下进行cDNA模板转换；

所述模板转换寡核苷酸从5’端到3’端为：GCTCTTCCGATCTKK+2个核糖鸟苷+一个LNA鸟苷，并在5’端以AMO修饰；其中所述模板转换寡核苷酸在GCTCTTCCGATCTKK序列与核糖鸟苷之间还包括表达定量分子标签，所述表达定量分子标签为6个任意碱基；

5)在第二链生成后，利用有限的循环以通用引物和Index引物进行扩增获得cDNA，同时完成cDNA文库构建，

其中所述通用引物为SEQ ID No.2：

5’NH2-C6-

AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTMM；

所述Index引物为SEQ ID No.3：

5’NH2-C6-

CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATNNNNNNGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTKK，其中NNNNNN为Index，N为任意碱基。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述逆转录酶选自Invitrogen^TM公司SuperScript^TMII Reverse Transcriptase、或Invitrogen^TM公司SuperScript^TMIIIReverse Transcriptase、Thermo Scientific^TM公司Maxima H Minus ReverseTranscriptase、RevertAid H Minus Reverse Transcriptase。

3.一种对细胞内转录本绝对定量的方法，包括：

对根据权利要求1或2所述的方法建立的cDNA文库测序后，找出包含GCTCTTCCGATCTKK序列+所述表达定量分子标签+GGG加部分转录本序列的Reads，通过部分转录本序列，将其特异性的比对到基因上，然后分析所述表达定量分子标签的变式个数，如某一种变式出现多次，那么认为该情况来自于PCR扩增中的Duplication，计数为1，去重后的变式个数，即为表达量绝对定量值。