[发明专利]一种单细胞RNA逆转录与文库构建的方法

说明书

本发明属于转录组分析领域，涉及到一种快速进行单细胞RNA逆转录与文库构建的方法。本发明能在5‑6小时内,由1‑2000个细胞或10pg‑20ng经提取的真核生物总RNA为起始，扩增出20‑500ng高质量全长双链cDNA，并获得符合下游分析要求的高质量cDNA文库。此发明有效避免了cDNA合成过程中的3’偏好性和基因组DNA的污染，表达定量分子标签可辅助基因表达量计算，同时在完整扩增RNA序列信息的同时该表达定量分子标签还可保留链来源信息。本发明可获得95％以上的逆转录与扩增建库成功率，cDNA文库可无缝衔接Illumina主流测序平台，下机数据(5M Reads)可检测到90％以上的基因表达，基因表达一致性超过90％，扩增无明显偏倚，且需要的样本投入量更少。

技术领域

本发明属于转录组分析领域，涉及到一种快速的单细胞RNA逆转录与文库构建方法。

背景技术

转录组是指某个物种或特定细胞在某一生理功能状态下，细胞内所有转录的mRNA产物的集合，包含了时间和空间的限定，是连接基因组遗传信息与生物功能的蛋白质组的必然纽带。

转录组分析包括但不限于：编码基因的分析、翻译蛋白的预测、外显子内含子的剪切拼接、转录本的结构分析功能分析，mRNA二级结构，基因的差异表达等等。目前成熟可靠的转录组分析手段包括RT-qPCR分析基因表达量、芯片杂交平台分析分析某些已知基因的转录活动、或者高通量测序技术等。

其中应用高通量测序技术(下一代测序技术，NGS)进行转录组测序(RNA-seq)是一种快捷可靠的获取转录组信息的方法。相对于传统的RT-qPCR平台或芯片杂交平台，NGS技术应用于转录组分析无需预先针对已知的序列设计探针或引物，即可在转录本水平和基因水平对整体转录活动进行检测，并且具有定量更准确，检测通量更高，检测范围更广等优点。此外，在分析转录本结构和表达水平的同时，还能发现未知转录本和稀有转录本，精确的识别可变剪切位点以及可能的点突变，提供最全面的转录组信息。

准确深入地分析转录组，有助于全面理解细胞基因表达和调控网络的作用。相同组织细胞的基因型几乎一致，但细胞亚群的表达往往不同；不同组织的细胞各自拥有独特的转录组。研究这些转录组的细微差异能够从不同的生理学功能和表型角度阐释基因调控网络。一般转录组实验通常需要成千上万甚至上百万个细胞。但早期胚胎细胞和干细胞等只能收集到微量细胞，这就要求实验中利用尽可能少的细胞，最好是在单细胞水平进行转录组分析。最新研究表明，相似细胞的基因表达具有异质性，这种异质性是由不同的衍生基因组、细胞循环和微环境等决定的。常规方法得到的是大量细胞基因表达信息的共性，难以显示彼此的异质性。对单细胞转录组的分析，不仅能研究基因表达的异质性，也能研究表达的随机性，进一步揭示与发育、疾病等相关的一系列重要信息。因此在单细胞水平进行转录组分析具有重要的科学意义也是现实的迫切需要。

理论上以NGS技术进行RNA-seq能在单细胞水平上进行，并且根据不同深度的分析，最终能获得整体水平全部基因的表达信息。此方法具有如下优点：a.分辨率高，起始样品量为单个细胞；b.灵敏度高；c.数字化信号，可以直接检测单个碱基差异、基因家族中相似基因以及可变剪接造成的不同表达；d.检测范围广，不仅能检测基因，还能检测RNA拼接体；e.重现性好。此方法最重要的环节是单细胞mRNA表达分析，即通过获得研究对象mRNA(转录本，基因组转录区域)的信息，鉴定转录发生位点，可变剪切等，其精确的计数方法更可对基因进行精确的定量分析。单细胞mRNA表达分析的重要前提是单细胞中痕量的mRNA(6-10pg)或pg级别的mRNA被高效且均一的逆转录和扩增。

实践中，单细胞mRNA测序从样本制备到数据处理，从单细胞的分离和处理到扩增时灵敏度和偏向性都存在很多技术问题。自2009年汤富酬等人在mRNA-Seq whole-transcriptome analysis of a single cell.Nat Methods.6(5):377–82.首次报道单细胞RNA测序技术以来，许多新颖的技术被开发出来，可以更快速、更低成本地提供更多信息。与本专利相关的重要的单细胞RNA测序技术有：