[发明专利]基于CRISPR靶向基因组修饰技术建立荧光素酶knock-in细胞系的方法

权利要求书

1.一种基于CRISPR靶向基因组修饰技术建立荧光素酶knock-in细胞系的方法，其特征在于，按下列步骤实施：

1)在目的基因SREBP1的终止密码子下游设计并合成相应的sgRNA，室温退火后连入pU6-sgRNA1.0，筛选后获得sgRNA表达组件，并检测其打靶效率；

2)将检测过的打靶效率高的sgRNA表达组件与Cas9基因克隆至一个表达载体，获得pCMV-Cas9-SV40pA-U6-sgRNAs-SV40pA；

3)构建靶向SREBP1基因的打靶载体pUC19/SREBP1-donor，该打靶载体pUC19/SREBP1-donor的结构为两部分，第一部分是与断裂位点上下游分别具有相同序列的上下游同源臂；第二部分是位于上下游同源臂之间的待重组入基因组靶位点的T2A-Luciferase-CMV-eGFP-T2A-Neomycin-SV40pA DNA片段；

4)将pCMV-Cas9-SV40pA-U6-sgRNAs-SV40pA与pUC19/SREBP1-donor共转HEK293细胞系，待细胞系稳定后，加1.0mg/mL的G418筛选10天，待细胞系稳定后，再加10μg/mL的GCV筛选3周，待细胞系稳定过后，对细胞经有限稀释法进行克隆化，再对克隆化后的细胞进行PCR鉴定并测序，证实携带荧光素酶报告基因的打靶载体在目标位点处的正确重组，最终获得单一稳定的HEK293-SREBP1-T2A-luciferase-KI细胞系；

5)克隆并构建SREBP1基因的转录激活因子LXRα表达载体pUC19/CMV-LXRα，该表达载体pUC19/CMV-LXRα被用于SREBP1基因的转录激活实验研究；

6)验证HEK293-SREBP1-T2A-luciferase-KI细胞系中Luciferase表达变化是否可以真实反映内源性SREBP1基因的相对表达量及表达变化；使用所构建的SREBP1基因的转录激活因子LXRα表达载体pUC19/CMV-LXRα分别转染HEK293-SREBP1-T2A-luciferase-KI细胞系和野生型HEK293细胞系，并对HEK293-SREBP1-T2A-luciferase-KI细胞系中的Luciferase活性及HEK293细胞系中SREBP1分子的mRNA表达水平分别进行检测；通过对knock-in细胞系中Luciferase表达活性与HEK293细胞中的SREBP1 mRNA表达水平及变化的比较，进一步验证HEK293-SREBP1-T2A-luciferase-KI细胞系中的Luciferase活性是否可以准确反映SREBP1分子的相对表达变化。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中所述的合成相应的sgRNA为针对SREBP1的终止密码子下游设计的sgRNA，其中：

sgRNA1序列为：GTCGAAGCTTTGAAGGCCGA；

sgRNA2序列为：GATCTTGACCCTAAGACCGG；

sgRNA3序列为：GTGGCCGATCGGGGCACTGC；

sgRNA4序列为：GCTTTCCCGGACTGCAAGCA。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4)中所述的HEK293细胞系为人胚肾细胞系HEK293。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的pCMV-Cas9-SV40pA-U6-sgRNAs-SV40pA与pUC19/SREBP1-donor以质量比4μg：8μg配置。