[发明专利]基于CRISPR靶向基因组修饰技术建立荧光素酶knock-in细胞系的方法

说明书

本发明涉及一种基于CRISPR靶向基因组修饰技术建立荧光素酶knock‑in细胞系的方法，采用CRISPR/Cas9技术在基因组上SREBP1基因的3’端原位整合入T2A‑Luciferase报告基因，建立了SREBP1‑T2A‑Luciferase的knock‑in细胞系，并验证了此细胞系中外源基因在基因组上的定点整合。同时利用已报道的对SREBP1有激活作用的转录因子LXRα对SREBP1‑T2A‑Luciferase细胞系进行转录激活，结果表明SREBP1‑T2A‑Luciferase细胞系内的Luciferase表达水平可以准确灵敏地反映细胞系内SREBP1分子表达水平。该细胞系的建立将有助于SREBP1基因功能研究及筛选影响SREBP1表达的小分子化学药物，为脂代谢及其相关研究提供一种新的实验思路及解决方案。

技术领域

本发明属于分子生物学领域，涉及利用CRISPR/Cas9介导的靶向基因组插入技术建立细胞系，具体涉及一种基于CRISPR/Cas9靶向基因组修饰技术建立KI-T2A-Luciferase细胞系的新方法。

背景技术

CRISPR/Cas9是细菌和古细菌长期演化形成的免疫防御系统，该系统是利用CRISPR-derivedRNA(crRNA)通过碱基配对与trans-activating RNA结合形成复合物，Cas9内切酶在此复合物引导下对与crRNA配对的序列进行定点切割。所以，通过人工设计具有引导作用的sgRNA(short guide RNA)，可以引导Cas9对宿主细胞DNA进行定点切割，然后通过非同源末端连接(non-homologous end joining，NHEJ)或同源重组(homologousrecombination，HR)两种修复途径的机制进行修复，实现基因编辑。

目前检测基因的表达调控主要是通过RT-PCR、Western Blot和将目标基因启动子克隆到携带报告基因的表达检测载体中等手段来实现。RT-PCR过程繁琐且不稳定，WesternBlot抗体标记费时昂贵，这些都不利于高通量筛选；由于基因组本身存在表观遗传学修饰，将启动子克隆到携带报告基因的表达检测载体中的方法无法模拟基因组的真实状态，因此难以准确反映基因组上基因表达情况。

随着今年来报告基因技术的不断发展，荧光蛋白报告基因、荧光素酶报告基因等已成为基础研究中常用的细胞标记与示踪的方法，由于其具有方便快捷、安全直观的优点，不仅普遍应用于探索构建分子通路的分子生物学实验，而且越来越广泛用于筛选药物所构建的细胞系。

发明内容

本发明的目的在于，利用CRISPR/Cas9技术，提供一种基于CRISPR/Cas9靶向基因组修饰技术建立KI-T2A-Luciferase细胞系的新方法。

为了实现上述任务，本发明采取如下的技术解决方案：

一种基于CRISPR/Cas9靶向基因组修饰技术建立KI-T2A-Luciferase细胞系的方法，其特征在于，按下列步骤实施：

1)在目的基因SREBP1的终止密码子下游设计并合成相应的sgRNA，室温退火后连入pU6-sgRNA1.0，筛选后获得sgRNA表达组件，并检测其打靶效率；

2)将检测过的打靶效率高的sgRNA表达组件与Cas9基因克隆至一个表达载体，获得pCMV-Cas9-SV40pA-U6-sgRNAs-SV40pA；

3)构建靶向SREBP1基因的打靶载体pUC19/SREBP1-donor，该打靶载体pUC19/SREBP1-donor的结构为两部分，第一部分是与断裂位点上下游分别具有相同序列的上下游同源臂；第二部分是位于上下游同源臂之间的待重组入基因组靶位点的T2A-Luciferase-CMV-eGFP-T2A-Neomycin-SV40pA DNA片段；