[发明专利]一种含有能够降解4-氨基喹啉功能基因的质粒

权利要求书

1.一种含有能够降解4-氨基喹啉功能基因的质粒，其特征在于，该质粒由菌株微杆菌Microbacterium sp.M.CWS5的菌液经过提取与纯化得到的；提取与纯化含有降解4-氨基喹啉功能基因的质粒所用的菌株微杆菌Microbacterium sp.M.CWS5在2017年10月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，该中心位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，菌种保藏号为CGMCC No.14840；从菌株微杆菌Microbacterium sp.M.CWS5中提取与纯化含有降解4-氨基喹啉功能基因的质粒的具体方案为：

(1)向体积为500mL的锥形瓶内加入400mL基础培养基、1.0mL微量金属液、0.1mL质量浓度为10mg/L的维生素c溶液，摇匀后作为液体培养基备用；其中基础培养基的组成为：NH₄NO₃:1.7g·L^-1，KH₂PO₄:1.0g·L^-1，K_.2HPO₄:1.0g·L^-1，MgCl₂:0.30g·L^-1，CaCl₂·2H₂O:0.15g·L^-1；微量金属液的组成为：CoCl₂·6H₂O:55mg·L^-1，CuCl₂:0.35mg·L^-1，H₃BO₃:11.0mg·L^-1，MnCl₂·4H₂O:45mg·L^-1，Na₂MoO₄·2H₂O:5.5mg·L^-1，NiCl₂·2H₂O:4.5mg·L^-1，ZnCl₂:4.5mg·L^-1；

(2)在超净工作台中向体积为100mL的锥形瓶中加入4.0mL质量浓度为0.5g/L的4-氨基喹啉丙酮溶液，为除去丙酮将锥形瓶开口放置2天；

(3)向由步骤(2)得到的锥形瓶内加入40mL按步骤(1)配制的液体培养基；

(4)在超净工作台中挑取菌株微杆菌Microbacterium sp.M.CWS5，将其接种至由步骤(3)得到的锥形瓶中，然后在温度为25～30℃、转速为100r/min的振荡器中培养20～22天，得到菌液A；

(5)将步骤(4)得到的菌液A转移到离心管中，在10000r/min条件下离心10min，弃去上清液，得到菌体B；

(6)将10mL pH值为9.0浓度为0.10M的NaH₂PO₄缓冲液加入到菌体B中，旋涡振荡5min后再进行超声波振荡15min，在10000r/min条件下离心10min，弃去上清液，得到菌体C；

(7)将35mL浓度为0.48M的三羟基甲基氨基甲烷溶液，15mL浓度为0.23M的EDTA溶液和15mL浓度为0.78M的KCl溶液加入到10mL质量百分比浓度为3.0％的氯化十六烷基三甲胺溶液中，摇匀后得到混合液A；

(8)将步骤(6)得到的菌体C和2.5毫克N-乙酰胞壁质聚糖水解酶加入到12mL混合液A中，在0～4℃条件下振荡10min，然后加入1.5mL质量浓度为50g/L的乙氧基化烷基硫酸钠溶液，旋涡振荡5min后在55℃条件下水浴振荡1h，在10000r/min条件下离心10min，收集上清液，得到混合液B；

(9)将15mL浓度为5.5M的醋酸钾和25mL甲基叔丁基醚加入到15mL异丙醇中，摇匀后得到混合液C；

(10)将混合液B加入到8mL混合液C中，在0～4℃条件下振荡15min，在10000r/min条件下离心10min，收集上清液，得到混合液D；

(11)将混合液D加入到离心纯化柱上，将离心纯化柱放入到离心管中，在10000r/min条件下离心10min，倒去离心管中的液体；重复这一过程，直至所有混合液D都经过离心纯化柱纯化；

(12)将5mL浓度为4.8M的盐酸胍、8mL浓度为4.5M的醋酸钾和2毫升2,3-二氟苯甲醇加入到85mL无水乙醇中，摇匀后得到混合液E；

(13)将0.8mL混合液E加入到经步骤(11)处理后得到的离心纯化柱中，在0～4℃条件下振荡15min，将离心纯化柱放入到离心管中，在10000r/min条件下离心10min，倒去离心管中的液体；

(14)将4mL浓度为15mM的三羟基甲基氨基甲烷溶液和3mL浓度为3.5M的NaCl溶液加入到8mL浓度为2.5mM的EDTA溶液中，摇匀后得到混合液F；

(13)将0.8mL混合液F加入到经步骤(13)处理后得到的离心纯化柱中，在55℃条件下振荡20min，在10000r/min条件下离心5min，离心管中得到的液体即为含有降解4-氨基喹啉功能基因的质粒溶液，在-20℃保存备用。