[发明专利]一种在早期胚胎组织免疫组化中保持胚胎完整性的方法

权利要求书

1.一种在早期胚胎组织免疫组化中保持胚胎完整性的方法，包括以下步骤：

1)溶液配制：4％多聚甲醛，0.5％Triton X-100，双氧水20％聚乙烯吡咯烷酮储存溶液和0.1μg/mL 4',6-二脒基-2-苯基吲哚均用PH范围为7.2-7.4的0.01mol/L磷酸盐缓冲液稀释，并且免疫组化用4％多聚甲醛，0.5％Triton X-100、双氧水和磷酸盐缓冲液中均加入聚乙烯吡咯烷酮储存液，添加浓度分别为2％、4％、6％、8％、10％；

2)胚胎清洗：在显微镜下，将体外培育的2细胞期、4细胞期、8细胞期和16细胞期的孤雌胚胎、孤雄胚胎或体外受精胚胎从培养液中捡出，用38.5℃下预热的加入聚乙烯吡咯烷酮的0.01mol/L磷酸盐缓冲液漂洗3次，每次5min；

3)胚胎固定：用加入聚乙烯吡咯烷酮溶液的4％的多聚甲醛在室温下固定胚胎1h，然后用预热的加入聚乙烯吡咯烷酮溶液的磷酸盐缓冲液漂洗3次，每次5min；

4)通透：用加入聚乙烯吡咯烷酮的0.5％Triton X-100室温透化30min，然后用预热的加入聚乙烯吡咯烷酮溶液的磷酸盐缓冲液漂洗3次，每次5min；

5)去除内源性过氧化物酶：用加入聚乙烯吡咯烷酮的0.01mol/L磷酸盐缓冲液配置新鲜的3％H₂O₂，室温封闭5-10min，用预热的含聚乙烯吡咯烷酮的磷酸盐缓冲液漂洗3次，每次5min；

6)封闭：滴血清(与二抗同一来源)孵育，37℃封闭30min；

7)一抗孵育：轻轻吸除封闭液，加按抗体说明用磷酸缓冲液稀释的一抗覆盖于胚胎中，将其放在湿盒中，4℃过夜；

8)二抗孵育：用预热的含聚乙烯吡咯烷酮的磷酸盐缓冲液漂洗3次，每次5min，加按抗体说明用磷酸缓冲液稀释的荧光标记二抗，37℃中避光孵育30min；

9)4',6-二脒基-2-苯基吲哚染核：二抗孵育后的胚胎用含聚乙烯吡咯烷酮的磷酸盐缓冲液漂洗3次，每次5min，取10μL 0.1μg/mL 4',6-二脒基-2-苯基吲哚溶液于胚胎上，室温5min；

10)封片：用含聚乙烯吡咯烷酮的磷酸盐缓冲液漂洗3次，每次5min，95％甘油封片，盖上盖玻片；

11)荧光观察：在共聚焦显微镜下观察荧光分布。

2.根据权利要求1所述的一种在早期胚胎组织免疫组化中保持胚胎完整性的方法，其特征在于：所述聚乙烯吡咯烷酮溶液为PH范围为7.2-7.4的0.01mol/L磷酸盐缓冲液稀释溶液。