[发明专利]一种在早期胚胎组织免疫组化中保持胚胎完整性的方法

说明书

本发明公开了一种早期胚胎组织的免疫组化中保持胚胎完整性的方法，属于动物生物技术领域。该方法采用聚乙烯吡咯烷酮溶液添加于早期胚胎免疫组化所用磷酸盐缓冲液、多聚甲醛、Triton X‑100、双氧水中，防止胚胎贴壁，在整个免疫组化过程中可保持胚胎完整性，提高免疫组化效果。本发明所采用的技术方案主要针对体外胚胎，在常规免疫组化步骤基础上进行了调整，调整了组织处理部分试剂成分，有效提高了免疫组化效果。本发明针对免疫组化技术存在的不足，扩大了应用范围，具有操作简便，生产成本低等优点。

技术领域

本发明涉及一种在早期胚胎组织免疫组化中保持胚胎完整性的方法，属于动物生物技术领域。

背景技术

聚乙烯吡咯烷酮简称PVP，是N-乙烯基-2-吡咯烷酮发生聚合生产的高分子化合物。其是一种白色有吸湿性的粉末，无臭或微臭，可溶于水、乙醇、氯仿和多数有机溶剂，不溶于乙醚，毒性较小。聚乙烯吡咯烷酮可以单体乙烯基吡咯烷酮为原料，通过本体聚合、溶液聚合等方法合成。作为一种合成水溶性高分子化合物，具有水溶性高分子化合物一般性质，胶体保护作用、成膜性、粘结性、吸湿性、增溶或凝聚作用。其溶液毒性很低、无生理形容性。在医药、食品、化妆品等领域广泛应用。

体外胚胎培养为探究早期胚胎发育提供了必要的材料，是一种生殖生物技术，其加快了畜禽遗传改良，在动物育种中有着重要意义。这一技术也是哺乳动物胚胎工程研究中的一个重要工具，其为探究体内胚胎发育机制、改良胚胎发育质量奠定了良好的基础，是体内胚胎系统的一个有效的反映，也是发育生物学和新兴生物技术中一个重要的研究技术。但在培养过程中，胚胎容易贴壁，在换培养液移动胚胎时会使其囊壁破裂，所以在整个培养过程中将丢失很多胚胎，建设了试验样本。利用聚乙烯吡咯烷酮水溶性、粘性及低毒性，在胚胎培养液中添加聚乙烯吡咯烷酮，可降低胚胎贴壁，保持胚胎的完整性，基于此，在胚胎免疫组化试验中，所用试剂添加一定浓度的聚乙烯吡咯烷酮，亦可减少胚胎贴壁，保持胚胎完整性，增加试验效果。

本方法在胚胎免疫组化中的应用，建立了可行的试验方法，操作简便易行，试验效果明显，为胚胎工程研究提供了切实可行的依据。

发明内容

技术问题 本发明的目的在于提供一种在早期胚胎组织免疫组化中保持胚胎完整性的方法。

技术方案

1、一种在早期胚胎组织免疫组化中保持胚胎完整性的方法，包括以下步骤：

1）溶液配制：4%多聚甲醛，0.5% Triton X-100，双氧水20%聚乙烯吡咯烷酮储存溶液和0.1μg/mL4',6-二脒基-2-苯基吲哚均用PH范围为7.2-7.4的0.01mol/L磷酸盐缓冲液稀释；且免疫组化用4%多聚甲醛，0.5% Triton X-100、双氧水和磷酸盐缓冲液中均加入聚乙烯吡咯烷酮储存液，添加浓度分别为2%、4%、6%、8%、10%。

2）胚胎清洗：在显微镜下，将体外培育的2细胞期、4细胞期、8细胞期和16细胞期的孤雌胚胎、孤雄胚胎或体外受精胚胎从培养液中捡出，用38.5℃下预热的加入聚乙烯吡咯烷酮的0.01mol/L磷酸盐缓冲液漂洗3 次，每次5min；

3）胚胎固定：用加入聚乙烯吡咯烷酮溶液的4%的多聚甲醛在室温下固定胚胎1h，然后用预热的加入聚乙烯吡咯烷酮溶液的磷酸盐缓冲液漂洗3次，每次5min；

4）通透：用加入聚乙烯吡咯烷酮的0.5% Triton X-100室温透化30 min，然后用预热的加入聚乙烯吡咯烷酮溶液的磷酸盐缓冲液漂洗3次，每次5 min；

5）去除内源性过氧化物酶：用加入聚乙烯吡咯烷酮的0.01mol/L磷酸盐缓冲液配置新鲜的3% H₂O₂，室温封闭5～10min，用预热的含聚乙烯吡咯烷酮的磷酸盐缓冲液漂洗3 次，每次5 min；

6）封闭：滴血清（与二抗同一来源）孵育，37℃封闭30 min；