[发明专利]一种生物工程培育眼全层角膜的方法

权利要求书

1.一种胶原蛋白培养基的制备方法，其特征在于，胶原蛋白溶液与缓冲液混合，然后加入EDC溶液和NHS溶液，调节pH为5.4-5.6后，固化，然后采用10±2mM PBS洗脱得到；

其中，EDC、NHS和胶原蛋白的3-胺基团的摩尔量比例为3：2.8-3.5：2.8-3.5。

2.根据权利要求1所述的胶原蛋白培养基的制备方法，其特征在于，所述胶原蛋白溶液的浓度为13.7w/w％±0.5w/w％，所述缓冲液为MES缓冲液，优选地，所述MES缓冲液的浓度为0.625±0.05M；

进一步地，所述MES缓冲液与所述胶原蛋白溶液的体积为1:0.8-1.5；

优选地，所述EDC溶液和NHS溶液为EDC和NHS的混合液，所述混合液中，EDC的浓度为200±5mg/ml，NHS的浓度为120±5mg/ml，所述混合液的溶剂为0.625±0.05M的MES缓冲液；

进一步地，所述固化前还包括：混合液放入模具，然后置于95％-100％湿度的室温下放置15-18h；

进一步地，所述固化的温度为37±2℃；

进一步地，所述洗脱后得到的水凝胶样培养基浸入含有青霉素和链霉素以及1％±0.1％氯仿的10±1mM PBS中，2-10℃保存。

3.权利要求1或2所述的胶原蛋白培养基的制备方法制得的胶原蛋白培养基；

进一步地，所述胶原蛋白培养基的表面铺上羊膜，然后在所述羊膜的表面涂覆N-异丙基聚合物。

4.一种眼角膜表皮层的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：

口腔粘膜组织制得口腔粘膜上皮细胞的单细胞悬浮液；

所述单细胞悬浮液接入权利要求3所述的胶原蛋白培养基上，并在接种的单细胞的外围放入T3T饲养细胞和丝裂霉素C，用以分泌生长激素和细胞因子；

培养得到角膜上皮层。

5.根据权利要求4所述的眼角膜表皮层的培养方法，其特征在于，所述口腔粘膜组织采用分散酶II处理，去除上皮层后，收集得到上皮细胞，用消化液处理，得到所述口腔粘膜上皮细胞的单细胞悬浮液；

进一步地，所述分散酶II的浓度为2.8-3.5mg/ml，采用所述分散酶II于37±2℃下处理50-70min；

进一步地，所述消化液为质量浓度为0.2％-0.3％的胰蛋白酶与质量浓度为0.005％-0.015％的EDTA的混合溶液，所述消化液处理的时间为12-18min；

优选地，所述培养的温度为37±2℃，所述培养的时间为12-15天。

6.一种眼角膜间质层的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：

将大腿皮肤的真皮层，制得成纤维细胞单细胞；

所述纤维细胞单细胞种植在不同的透明丝素蛋白膜，所述透明丝素蛋白酶均浸泡在含青霉素和链霉素的高糖DMEM培养液中，进行二维培养；

不同的透明丝素蛋白膜重叠在一起，进行三维培养，得到角膜间质层。