[发明专利]一种生物工程培育眼全层角膜的方法

说明书

本发明涉及细胞培养领域，特别涉及一种生物工程培育眼全层角膜的方法，角膜各层分别培养，优点在于当病人不需要全角膜移植时，只需要培养患者需要的角膜层即可。本发明中提供的全角膜的制备方法，角膜表皮层和间质层的种子细胞是自体细胞，并且角膜内皮细胞来自捐赠者，可通过培养得到大量的内皮细胞，避免了捐赠者来源的有限性。本发明以胶原蛋白培养基作为表皮层和间质层的胶合介质，可以促进人生物工程角膜的神经内生长。本发明提供的全角膜或部分角膜，均具有良好的光学特性，手术后，患者全部恢复视力；并且角膜具有稳定的生化特性，无晚期角膜溶解，良好的生物相容性，无排斥反应。

技术领域

本发明涉及细胞培养领域，具体而言，涉及一种生物工程培育眼全层角膜的方法。

背景技术

角膜疾病是目前世界上发病率高，由于治疗手段有限，因此是致盲的主要原因之一。目前治疗角膜疾病的主要方法是全角膜或板层角膜移植。由于受到角膜合格供体来源缺乏的限制，绝大部分因角膜疾病失明或部分丧失视力的患者得不到有效的治疗。

近十年来，生物组织工程技术的发展为体外构建生物角膜提供了技术可能，生物反应器更好的模拟了人体内的生存环境，利用种子细胞和支架材料的方式可以体外制备组织工程角膜；同时，很多技术在动物异种角膜脱细胞处理后可以给临床提供其他的选择。

目前国内形成产业化的就是角膜基质层的生产，如猪眼角膜基质层脱细胞处理。但是，这只是角膜中部的一个层，也是生物组织工程技术最成熟的部分。大部分病人需要角膜内皮层或角膜前深部板层(角膜表皮层和角膜基质层)，因此全角膜或角膜内皮层，角膜前深部板层(角膜表皮层和角膜基质层)的生物工程培养是治疗因角膜疾患失明患者的重要一环，特别是角膜内皮层的培养，构建。

其他组织工程技术以异类或异体细胞为种子细胞，在支架上培植全层生物角膜，这不仅提高了感染转染病的风险，也存在潜在的组织免疫排斥反应的危险，导致手术失败。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种眼角膜各层以及全眼角膜的制备方法以及制得的各层和全眼角膜，为角膜的治疗提供良好的基础。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

一种胶原蛋白培养基的制备方法，胶原蛋白溶液与缓冲液混合，然后加入EDC溶液和NHS溶液，调节pH为5.4-5.6后，固化，然后采用10±2mM PBS洗脱得到；

其中，EDC、NHS和胶原蛋白的3-胺基团的摩尔量比例为3：2.8-3.5：2.8-3.5。

本发明提供的胶原蛋白培养基的制备方法，制得固体胶原蛋白培养基，为眼角膜表皮层和全角膜的培养提供良好的基础。

其中，EDC、NHS和胶原蛋白的3-胺基团的摩尔量比例可以为3：2.8：2.8、3：3：3、3：3.5：3.5、3：3.2：3.5等等。

本发明中，EDC为1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺的缩写；NHS为N-羟基琥珀酰亚胺的缩写。

进一步地，所述胶原蛋白溶液的浓度为13.7w/w％±0.5w/w％，所述缓冲液为MES缓冲液。

优选地，胶原蛋白溶液为无泡的人重组III型胶原蛋白溶液。

优选地，所述MES缓冲液的浓度为0.625±0.05M。

进一步地，所述MES缓冲液与所述胶原蛋白溶液的体积为1:0.8-1.5。如两者的体积比可以为1:0.8、1:1、1:1.2、1:1.5等等。

胶原蛋白溶液与MES缓冲液在冰水环境下进行充分混合，如可以在注射器混合系统混合。