[发明专利]利用CRISPR/Cas9技术构建Hutat2:Fc基因敲入单核细胞的实验方法

权利要求书

1.利用CRISPR/Cas9技术构建Hutat2:Fc基因敲入单核细胞的实验方法，其特征是：包括如下步骤：

1）CRISPR/Cas9打靶质粒的构建；

2）供体质粒的构建；

3) 分选原代单核细胞；

4）电脉冲穿孔法转染单核细胞；

5）敲入效率的鉴定；

所述步骤1）CRISPR/Cas9打靶质粒的构建；具体如下：

a)筛选得到针对人体基因组AAVS1位点的靶序列为SEQ ID No.1：GGGGCCACTAGGGACAGGATTGG；

b)针对上述位点，设计并合成sgRNA序列，具体为F-sgRNA序列为SEQ ID No.2：5’-3’CACCGGGGGCCACTAGGGACAGGATTGG；

R-sgRNA序列为SEQ ID No.3：

5’-3’AAACCCAATCCTGTCCCTAGTGGCCCCC；

F-sgRNA序列和R-sgRNA序列为合成的单链DNA片段；

c)将上述合成的单链DNA片段进行退火，形成双链DNA片段；

d)选取pX330质粒: pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9，利用限制性内切酶BbsⅠ 对pX330质粒进行酶切；

酶切体系建立：pX330质粒：1微克，10×缓冲液：2微升，BbsⅠ：1微升，去离子水：将总体系补齐至20微升，37℃孵育30分钟，利用T4连接酶将退火后的双链DNA片段连入pX330质粒；

连接体系建立：将上述酶切产物：100纳克，双链DNA片段：200纳克，10×缓冲液：2微升，T4连接酶：0.5微升，去离子水：将总体系补齐至20微升，室温孵育30分钟；将连接产物转化入DH-5α感受态细胞，挑取单克隆后测序验证并提取质粒以备后用；

所述步骤2）供体质粒的构建:利用T4连接酶于目的序列Hutat2:Fc的两端各连入1.5kb针对基因组AAVS1位点靶序列上下游的同源臂序列，选取PTA2质粒作为供体质粒载体，利用BamHⅠ和HindⅢ对PTA2质粒进行双酶切，利用T4连接酶将目的片段和同源臂序列连入PTA2载体中，30分钟后将连接产物转化入DH-5α感受态细胞，挑取单克隆后测序验证并提取质粒以备后用；

所述步骤4）电脉冲穿孔法转染单核细胞：取5×10⁵个单核细胞重悬于200微升电转缓冲液，并置于电转杯中，加入2微克打靶质粒和8微克供体质粒，操作过程中不能产生气泡，将电转杯置于冰上5-10分钟，于电穿仪上进行电穿，电穿完成后迅速将细胞悬液转移至1640完全培养基中，置于37℃，体积百分数为5% CO₂中培养9天以基因编辑。

2.根据权利要求1所述的利用CRISPR/Cas9技术构建Hutat2:Fc基因敲入单核细胞的实验方法，其特征是：所述退火条件：95℃ 5分钟；95℃开始，每循环2秒钟，每循环下降0.1℃，共200个循环；到达75℃，每循环1秒钟，每循环下降0.1℃，600个循环；15℃ 2分钟。

3.根据权利要求1所述的利用CRISPR/Cas9技术构建Hutat2:Fc基因敲入单核细胞的实验方法，其特征是：所述步骤3）分选原代单核细胞具体为：从血库取全血10毫升，按照体积比1:20加入单核细胞阴选抗体，室温孵育20分钟后，按照体积比1:1加入PBS缓冲液进行稀释，混匀后，将20毫升稀释血液沿试管壁缓慢的叠加到10毫升淋巴细胞分离液之上，并与分离液面形成明显的界面；梯度离心2000转/分钟离心20分钟，收集离心后的环状乳白色淋巴细胞层；加入40毫升PBS缓冲液，1200转/分钟离心10分钟，重复两次。按照体积比9:1加入NH₄Cl溶液于冰上孵育10分钟以裂解红细胞。加入10毫升PBS缓冲液，1200转/分钟离心5分钟，重复两次以备后用。

4.根据权利要求1所述的利用CRISPR/Cas9技术构建Hutat2:Fc基因敲入单核细胞的实验方法，其特征是：所述步骤4）中的电脉冲穿孔条件：电压为1200V，时间为20ms，脉冲为3pulses。

5.根据权利要求1所述的利用CRISPR/Cas9技术构建Hutat2:Fc基因敲入单核细胞的实验方法，其特征是：所述步骤5）敲入效率鉴定：通过Sanger测序或PCR检测目的序列的整合。