[发明专利]利用CRISPR/Cas9技术构建Hutat2:Fc基因敲入单核细胞的实验方法有效

专利信息
申请号: 201810028924.0 申请日: 2018-01-12
公开(公告)号: CN108559730B 公开(公告)日: 2021-09-24
发明(设计)人: 康文;王博文;孙永涛;左佳蕙;康文臻 申请(专利权)人: 中国人民解放军第四军医大学
主分类号: C12N5/10 分类号: C12N5/10;C12N15/90
代理公司: 北京挺立专利事务所(普通合伙) 11265 代理人: 倪钜芳
地址: 710038 *** 国省代码: 陕西;61
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摘要:
搜索关键词: 利用 crispr cas9 技术 构建 hutat2 fc 基因 单核 细胞 实验 方法
【说明书】:

发明涉及一种利用CRISPR/Cas9技术构建Hutat2:Fc基因敲入单核细胞的实验方法,其特征是:包括如下步骤:1)CRISPR/Cas9打靶质粒的构建;2)供体质粒的构建;3)分选原代单核细胞;4)电脉冲穿孔法转染单核细胞;5)敲入效率的鉴定。本发明方法具有简便易行,无需后期细胞筛选,即可获得较高的基因编辑效率,这大大增加了实验的可行性和应用前景。适用范围广等特点。

技术领域

本发明涉及一种实验方法,具体是一种利用CRISPR/Cas9技术构建Hutat2:Fc基因敲入单核细胞的实验方法。属于医学领域。

背景技术

近年来,获得性免疫缺陷病毒(HIV)的感染率逐年升高。抗病毒药物的发现和普及,使得HIV感染已经由一种急性致死性疾病逐渐变为一种慢性可控性疾病。随着患者生存时间的延长,HIV感染并发症发病率逐年提高,其中HIV相关神经认知紊乱受到广泛关注。HIV相关神经认知紊乱在HIV感染者中的发病率为40%-60%,大大的影响着患者的生存质量。

经研究发现,HIV转录激活因子(HIV-Tat)在HIV相关神经认知紊乱的发生发展中扮演着重要角色:一方面,HIV-Tat本身作为一种神经毒性因子可以直接损伤神经元和胶质细胞,另一方面,HIV-Tat可以激活HIV的转录和复制,促进HIV在神经系统中的扩散。因此,中和HIV-Tat对于HIV相关神经紊乱的治疗中具有重要意义。

由于血脑屏障的存在,普通的抗病毒药物无法到达中枢神经系统发挥药物作用,因此找到合适的穿越血脑屏障的方法不仅具有科学研究意义,也具有实际应用价值。常用的穿越血脑屏障的方法有以下几种:受体或载体介导的胞吞机制,电磁场、超声波等瞬时开放侵袭性手段以及细胞介导的跨越血脑屏障机制。其中,胞吞机制的实施对药物要求高,操作难度大,而且药物持续时间短;侵袭性手段的实施局部损伤大,患者耐受性差,这些方法实用价值较低。

在中枢神经系统细胞治疗方面单核细胞具有明显的优势。但是单核细胞体外增值和表达能力较差,目前还没有一种行之有效的针对单核细胞的基因编辑技术,从而大大限制了单核细胞在中枢神经系统治疗中的应用。

目前传统的基因编辑方法,慢病毒/腺病毒介导的细胞感染技术,脂质体介导的细胞转染技术以及ZFN/TALEN介导的基因定点插入技术。病毒介导的转染技术具有明显的生物安全问题,且其造成的基因随机整合可能影响基因组的稳定性;脂质体介导的细胞转染技术治疗性基因无法长期稳定表达;ZFN/TALEN介导的基因定点插入技术操作难度大,编辑效率低。如何将人源化的抗HIV-Tat抗体-Fc融合蛋白Hutat2:Fc敲入单核细胞,以期达到治疗目的是目前要解决的问题。

发明内容

本发明的目的利用CRISPR/Cas9技术构建Hutat2:Fc基因敲入单核细胞的实验方法。本发明方法具有简便易行,无需后期细胞筛选,即可获得较高的基因编辑效率,这大大增加了实验的可行性和应用前景。适用范围广等特点。

本发明的目的是通过以下措施来实现的:利用CRISPR/Cas9技术构建Hutat2:Fc基因敲入单核细胞的实验方法,其特征是:包括如下步骤:

1)CRISPR/Cas9打靶质粒的构建;

2)供体质粒的构建;

3)分选原代单核细胞;

4)电脉冲穿孔法转染单核细胞;

5)敲入效率的鉴定。

所述步骤1)CRISPR/Cas9打靶质粒的构建;具体如下:

a)筛选得到针对人体基因组AAVS1位点的靶序列为SEQ ID No.1:GGGGCCACTAGGGACAGGATTGG;

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