[发明专利]基于快速扫描阳极溶出伏安技术检测食源性致病菌的电化学免疫传感器的制备方法及其应用

权利要求书

1.一种基于快速扫描阳极溶出伏安技术检测食源性致病菌的电化学免疫传感器制备方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）捕获单元的制备

a. 将0.1～0.3 g FeCl₂•4H₂O和0.6～0.9 g FeCl₃•6H₂O溶于40～50 mL除氧的二次水中，氮气保护下搅拌使其混合均匀，逐滴加入28wt%氨水溶液直至反应液的pH=10，升温到80℃并维持此温度反应2 h，反应结束后，氮气保护下冷却至室温，水清洗至中性，定容至50mL，即得Fe₃O₄纳米颗粒溶液；

b. 将40～50 mL Fe₃O₄纳米颗粒溶液与0.4～0.6 mL 3-氨丙基三乙氧基硅烷混合，超声0.5 h后，室温下搅拌5～8 h，经磁分离、清洗、重新分散在50 mL水中，即得氨基化Fe₃O₄纳米颗粒溶液；

c. 在1～3 mL 氨基化Fe₃O₄纳米颗粒溶液中加入0.1～0.3 mL 2.5wt%的戊二醛溶液，室温下反应1～3 h，经磁分离、清洗后加入1～3 mL 10～50 μg/mL的食源性致病菌捕获抗体，室温下反应1～3 h后，经磁分离、清洗后，分散在10～20 mL pH=7.5～8.2的磷酸盐缓冲溶液中，即得捕获单元溶液；

（2）信号单元的制备

a. 称取5～10 g三聚氰胺粉末，马弗炉中500～600 ℃下煅烧3～5 h，真空干燥过夜后，即可得到氮化碳粉末，取0.8～1.5 g 氮化碳粉末加入到80～120 mL 4～6 M HNO₃溶液中，120～150 ℃下回流16～20 h，冷却到室温后，12000 rpm离心，水洗至溶液pH=7，将所得沉淀物连续超声16 h，真空干燥后即得石墨相氮化碳；

b. 在30～60 mL水中加入1～3 mL 10 mM AgNO₃溶液，加热至沸腾，再加入1～3 mL1wt%柠檬酸三钠溶液和300～500 μL 3 mM NaBH₄溶液，沸腾状态下剧烈搅拌1 h，冷却到室温后，离心，清洗，分散到40～60 mL水中，即得纳米银粒子溶液；

c. 在10～70 mL 纳米银粒子溶液中加入30～70 mg 石墨相氮化碳，室温下搅拌16～24 h，水洗离心，弃上清液，分散到40～60 mL水中，即得复合纳米材料AgNPs@g-C₃N₄溶液；

d. 取200 μL复合纳米材料AgNPs@g-C₃N₄溶液，加入120～150 μL含10～100 mmol/L 1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐和1～10 mmol/L N-羟基琥珀酰亚胺的混合溶液，0.8～1.2 M盐酸调pH为4.0～6.0，35 ℃下孵育1～2 h，离心，洗涤，水定容至200～300μL，用0.1～0.2 M NaOH溶液调pH为7.0～9.0，加入80～120 μL 0.01～1 μg/mL 食源性致病菌抗体后孵育3～5 h，再加入80～100 μL 2wt%牛血清白蛋白溶液孵育1～2 h以封闭活性位点，清洗，离心，分散到5～10 mL水中，即得信号单元sAb-AgNPs@g-C₃N₄；

（3）电化学免疫传感器的组装

a. 将磁性玻碳电极依次用1.0、0.3、0.05 μm Al₂O₃抛光至镜面，再依次用50vt%的乙醇溶液、50 vt %的硝酸水溶液和蒸馏水超声清洗；

b. 向磁性玻碳电极表面滴加5～10 μL捕获单元，然后滴加5～10 μL食源性致病菌样品溶液，室温孵育30～50 min后，水清洗，再加入5～10 μL信号单元，室温孵育30～50 min后，水清洗，即得电化学免疫传感器。

2.根据权利要求1所述的基于快速扫描阳极溶出伏安技术检测食源性致病菌的电化学免疫传感器制备方法，其特征在于：所述的食源性致病菌包括副溶血性弧菌、创伤弧菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和沙门氏菌。

3.一种利用权利要求1所述的电化学免疫传感器检测食源性致病菌的方法，其特征在于包括以下步骤

采用权利要求1所述的电化学免疫传感器为工作电极，铂丝电极为对电极，0.1 M KCl溶液为支持电解质溶液，采用100 V/s的电压扫描速度，进行快速扫描阳极溶出伏安分析，测量阳极溶出峰电流i_p；测定一系列不同浓度的食源性致病菌对应的阳极溶出峰电流i_p的大小，建立阳极溶出峰电流i_p与食源性致病菌浓度之间的定量关系；根据该定量关系即可测定未知样品中食源性致病菌浓度。