[发明专利]一种提高壳聚糖体外转运siRNA效率的方法

说明书

本发明公开了一种提高壳聚糖体外转运siRNA效率的方法，属于体外siRNA转运的技术领域。包括以下步骤：1)采用直接混合的方法制备壳聚糖/siRNA复合物；2)将步骤1)中形成的壳聚糖/siRNA复合物在含钙镁的汉克缓冲盐溶液(HBSS)中转染细胞。同时，本发明方法还提出“一步法”转染，即不采用预混合的方式，直接将壳聚糖溶液和siRNA同样按比例用量加入到含钙镁HBSS中转染细胞。该方法操作简单，实用性强，通过该方法能实现壳聚糖在多种细胞系中对siRNA的高效转运，大大降低了体外siRNA转运载体的成本。

技术领域

本发明属于体外siRNA转运技术领域，涉及优化壳聚糖体外转运方法，具体涉及一种提高壳聚糖体外转运siRNA效率的方法。

背景技术

RNA干扰技术是目前最为广泛应用的基因负向干预方法，不仅可以用于实验室基因沉默工具，同时也广泛的应用于siRNA相关治疗药物的研发。在RNA干扰技术的研究中，开发高效、安全、经济的siRNA转运载体是研究的主要方向。目前体外商品化的siRNA转运载体较多，包括lipofectamine 2000、RNAiMAX、N-TER Nanoparticle siRNA TransfectionSystem、Magic^TMsiRNA Transfection Reagent、jetPEI等，但具有价格昂贵、操作繁琐等缺点。因此，大量的研究集中于研发更为廉价的载体，其中壳聚糖具有潜在的应用价值。

然而虽然壳聚糖/siRNA被证实具有一定的基因沉默效果，但总体而言效率不佳。大部分学者因此抛弃了壳聚糖，也有学者尝试对壳聚糖进行化学修饰以提高其转染效率，但这些修饰无形中增加了经济成本。因此有必要转换思路，从其他方面进行思考尝试。

发明内容

本发明的目的在于提供一种提高壳聚糖体外转运siRNA效率的方法，该方法操作简便、提升效率显著、经济成本极低，具有很强的实用性，通过该方法进行细胞转染，可以实现高效、简便、廉价地转染细胞的目的。

本发明是通过以下技术方案来实现：

本发明公开了一种提高壳聚糖体外转运siRNA效率的方法，包括以下步骤：

1)分别配制壳聚糖溶液和siRNA溶液，将壳聚糖溶液和siRNA溶液按10：1的体积比混合均匀，形成壳聚糖/siRNA复合物；

2)将步骤1)形成的壳聚糖/siRNA复合物在含钙镁的汉克缓冲盐溶液中转染细胞。

优选地，壳聚糖溶液的浓度为0.8～1mg/ml，siRNA溶液的浓度为20μM。

优选地，所用壳聚糖的分子量为30～150kDa，脱乙酰度在85％～95％之间。

更进一步优选地，选用的壳聚糖的分子量(kDa)/脱乙酰度(％)分别为30/85、30/95、150/85、150/95；

优选地，溶解壳聚糖采用pH为5.5且浓度为0.2M的醋酸钠缓冲液；溶解siRNA采用RNase-free水。

优选地，步骤1)中，利用带正电的壳聚糖分子和带负电的siRNA分子静电作用力，采用直接混合形成转染复合物，具体是将壳聚糖溶液和siRNA溶液采用直接混合静电相互作用的方法，震荡30s，形成壳聚糖/siRNA复合物。

优选地，步骤2)中，在含钙镁的汉克缓冲盐溶液中转染细胞，具体操作为：

将细胞提前一天接种于24孔板内，在转染当天将培养液换成含钙镁的HBSS，随后加入壳聚糖/siRNA复合物，具体的用量以转染使用的培养液体积计算，使得siRNA的终浓度为40nM，转染4小时后换成普通培养液。

更进一步优选地，本发明将稳定表达绿色荧光蛋白GFP的Hela细胞、H1299细胞以及人间充质干细胞hMSC提前一天接种到24孔板内。