[发明专利]一种测定内/外源性血糖浓度的同位素稀释LC-MS方法

权利要求书

1.一种测定内/外源性血糖浓度的同位素稀释LC-MS方法，利用同位素稀释法精确测定血浆中内/外源性葡萄糖浓度，其特征在于该方法利用葡萄糖与对氨基苯甲酸发生席夫碱反应，生成物进一步还原，形成稳定衍生物，衍生物具有较高的质谱电喷雾离子化效率，同时利用D-[¹³C₆]葡萄糖标记物作为示踪物质和浓度内标物，结合液质联用多反应监测技术，对生物体内葡萄糖的代谢过程进行定量化的分析。

2.根据权利要求1所述的一种测定内/外源性血糖浓度的同位素稀释LC-MS方法，其特征在于该方法运用MRM二级质谱数据采集模式，选择性衍生化内/外源性葡萄糖后，四级杆选择特定母离子(m/z 358，364)进行碰撞诱导裂解，裂解发生于衍生化试剂羰基部位的标签上，提取特异性子离子(m/z 284，290)的EIC图，测定二者峰面积比例，计算血浆样品中内/外源性葡萄糖含量比例，能够降低血浆样品复杂基质中其它物质干扰，避免基质效应对定量测定的影响。

3.根据权利要求1所述的一种测定内/外源性血糖浓度的同位素稀释LC-MS方法，其特征在于，该方法利用衍生化反应提高质谱离子化效率，结合质谱多反应监测，具有高灵敏性，对葡萄糖具有高特异性，抗杂质干扰能力强。

4.根据权利要求1所述一种测定内/外源性血糖浓度的同位素稀释LC-MS方法，其特征在于，测定D-[¹³C₆]/[¹²C₆]葡萄糖衍生物目标子离子提取离子色谱图峰面积比例进行定量分析，能平衡基质效应的影响；衍生化后碰撞诱导裂解发生于衍生化试剂标签上，产生响应稳定的碎片离子，能够降低D-[¹³C₆]/[¹²C₆]葡萄糖由于同位素效应对诱导裂解产生的影响，定量准确度高。

5.根据权利要求1-4所述的任一种测定内/外源性血糖浓度的同位素稀释LC-MS方法，其特征在于该方法包括首先制备一系列浓度比例变化的D-葡萄糖和D-[¹³C₆]葡萄糖混合物标准样品，考察该发明方法定量动态范围、准确性和稳健性：

使用试剂：无水D-葡萄糖，纯度99.8％；D-[¹³C₆]葡萄糖，标记率99％，纯度98％；对氨基苯甲酸丁酯，纯度98％和氰基硼氢化钠，纯度95％；冰醋酸w/％≥99.5。

分别配制100mM天然葡萄糖和1mM D-[¹³C₆]葡萄糖储备液，取10μL、20μL、40μL、80μL、140μL、200μL、280μL、340μL、400μL 100mM天然葡萄糖储备液于2mL的EP管，每个EP管中加入等量70μL 1mM D-[¹³C₆]葡萄糖储备液(以D-[¹³C₆]葡萄糖作为示踪物和浓度内标物，终浓度为0.035mM)，加水稀释至2mL，涡旋混匀、充分平衡，制备得到不同浓度比的天然葡萄糖与D-[¹³C₆]葡萄糖混合标准溶液；

衍生化反应：称取对氨基苯甲酸丁酯，氰基硼氢化钠于反应瓶中，加入甲醇和冰醋酸，混匀，取上述不同浓度比例的天然葡萄糖与D-[¹³C₆]葡萄糖于不同的进样小瓶中，分别加入衍生化试剂混合溶液；在80℃条件下水浴加热反应1h，取出，冷却至室温；

纯化处理：用C18填料的固相萃取小柱纯化衍生化反应得到的混合样品，固相萃取小柱活化、平衡后，将样品转移至固相萃取小柱，用1mL乙腈-水，5:95，V/V洗两次，再用1mL乙腈-水，30:70，V/V洗脱，洗脱液收集于进样小瓶中，进行LC-MS/MS实验；

使用DataAnalysis 4.1Bruker软件对实验数据进行分析，选择特征碎片离子，m/z284，290EIC图谱，使用高斯拟合对色谱峰进行平滑处理并积分；根据EIC图谱峰面积，计算得到天然葡萄糖与D-[¹³C₆]葡萄糖的浓度比例，并与理论的摩尔浓度比例进行比较，结果显示较高的一致性。

6.根据权利要求1-4所述的任一种测定内/外源性血糖浓度的同位素稀释LC-MS方法，其特征在于进一步测定健康生物体和患糖尿病生物体血浆样品中内/外源性葡萄糖的绝对浓度随时间的变化，血浆样品处理和制备包括下述步骤：

血浆样品沉淀蛋白处理：将血浆样品从-80℃冰箱取出，待血浆样品室温解冻、平衡后，吸取20μL血浆，加入80μL乙腈沉淀蛋白，涡旋30s，在4℃下以12000×g离心10min，取上层清液，使用真空离心浓缩仪旋转干燥，再用20μL超纯水重溶解；

衍生化反应：衍生化反应及后续纯化处理方法如上所述，取20μL以上重溶解样品，加100μL混合衍生化试剂，于80℃水浴锅中反应1h；

比较健康生物体与患糖尿病生物体血浆中内/外源性葡萄糖浓度的变化，得出糖尿病生物体外周肌肉组织对葡萄糖的利用率更低，糖尿病个体血浆中内源性葡萄糖下降幅度更大。