[发明专利]一种测定内/外源性血糖浓度的同位素稀释LC-MS方法

说明书

本发明提供一种测定血浆样品中内/外源性葡萄糖浓度的方法，即结合液质联用(LC‑MS)多反应监测(multiple reaction monitoring，MRM)技术与衍生化反应，利用同位素稀释(isotope dilution)法精确测定血浆中内/外源性葡萄糖浓度。该方法利用葡萄糖与对氨基苯甲酸发生席夫碱反应，生成物进一步还原，形成稳定衍生物，衍生物具有较高的质谱电喷雾(electrospray ionization，ESI)离子化效率。利用D‑[¹³C₆]葡萄糖标记物作为示踪物质和浓度内标物，能够对生物体内葡萄糖的代谢过程进行定量化的分析。该方法能够精确测定血浆样品中内/外源性葡萄糖含量比例，避免基质效应对定量测定的影响。该发明方法具有选择性强，灵敏度高，所需血浆样品量少(20ul甚至更少)，抗干扰能力强，基质效应影响小，定量准确度高等优点。

技术领域

本发明属于分析化学方法领域，具体涉及一种利用LC-MS技术测定葡萄糖浓度的方法，更具体地说，涉及一种利用衍生化物标签裂解结合质谱多反应监测(multiplereaction monitoring,MRM)技术精确测定血浆中内/外源性葡萄糖浓度的定量分析方法。

背景技术

葡萄糖是生物体内新陈代谢不可缺少的营养物质，是人类生命活动所需能量的重要来源。血糖浓度是临床生化检验中的重要指标。在临床上，监测血糖浓度可以为许多疾病例如糖尿病、高血压、心脑血管疾病病症诊断、病情观察、治疗监控等提供客观依据，因此，对其准确测定具有重要意义。

血糖浓度的检测方法在医学上常用的有氧化酶-偶联比色法(GOD-POD)、已糖激酶法(HK)、葡萄糖脱氢酶法(GDH)等。这些方法具有快速、高效的特点，但是，均不能有效区分内源性和外源性葡萄糖。准确测定生物体血液中内源性与外源性葡萄糖浓度的变化，有利于研究机体血糖的代谢动力学过程，可以用于评价降血糖药物的药效，有助于理解其药理学作用机制。

发明内容

本发明的目的是，采用衍生化标签裂解的间接MRM精确定量方法结合同位素稀释LC-MS测定内/外源性血糖浓度，以避免用LC-MS直接测定葡萄糖进行定量时离子化效率低，易受血浆中其他杂质干扰以及基质效应影响等问题。

为了实现本发明的上述目的，本发明提供了如下技术方案：

一种测定内/外源性血糖浓度的同位素稀释LC-MS方法，利用同位素稀释法精确测定血浆中内/外源性葡萄糖浓度，该方法利用葡萄糖与对氨基苯甲酸发生席夫碱反应，生成物进一步还原，形成稳定衍生物，衍生物具有较高的质谱电喷雾离子化效率，同时利用D-[¹³C₆]葡萄糖标记物作为示踪物质和浓度内标物，结合液质联用多反应监测技术，对生物体内葡萄糖的代谢过程进行定量化的分析。

根据所述的一种测定内/外源性血糖浓度的同位素稀释LC-MS方法，该方法运用MRM二级质谱数据采集模式，选择性衍生化内/外源性葡萄糖后，四级杆选择特定母离子(m/z 358，364)进行碰撞诱导裂解，裂解发生于衍生化试剂羰基部位的标签上，提取特异性子离子(m/z 284，290)的EIC图，测定二者峰面积比例，计算血浆样品中内/外源性葡萄糖含量比例，能够降低血浆样品复杂基质中其它物质干扰，避免基质效应对定量测定的影响。

根据所述的一种测定内/外源性血糖浓度的同位素稀释LC-MS方法，该方法利用衍生化反应提高质谱离子化效率，结合质谱多反应监测，具有高灵敏性，对葡萄糖具有高特异性，抗杂质干扰能力强。