[发明专利]一种慢病毒制备方法

权利要求书

1.一种慢病毒载体的制备方法，包括如下步骤：

(1)真核细胞的培养，(2)慢病毒载体包装生产；(3)病毒包装质粒的转染，(4)转染后培养，(5)收集细胞培养物，固液分离取液体部分，(6)液体部分的预处理，(7)浓缩纯化慢病毒；(8)在病毒缓冲液制剂中冷冻储存；

所述步骤(1)293T细胞的培养，包括细胞复苏，扩大培养和接种到工厂化培养装置大规模培养；

所述步骤(2)慢病毒载体包装生产是采用第三代病毒包装质粒系统进行CAR慢病毒载体包装生产，将获得的慢病毒转染真核细胞；

所述步骤(3)转染的方法优选阳离子聚合物基因转染法；

所述步骤(4)转染后培养是将转染的真核细胞接种到工厂化大规模培养装置；

所述步骤(5)收集细胞培养的液体部分包括不同培养时间的上清液；在一具体实施例中包括慢病毒转染真核细胞24～72小时内不同培养时间的细胞培养物的上清液；

所述步骤(6)液体部分的预处理的方式包括滤膜过滤；

所述步骤(7)浓缩纯化病毒包括超速离心。

其中所述步骤(8)中的病毒缓冲液制剂Buffer组成包含选自PBS磷酸盐缓冲液、0.5M蔗糖、人血清白蛋白(HAS)、N-(2-羟乙基)哌嗪-N'-2-乙烷磺酸(HEPES)Buffer、Hank Buffer、三羟甲基氨基甲烷(Tris)Buffer、氯化钠、勃脉力A(Plasmalyte A)、葡萄糖、葡聚糖中的一到多种；

所述包装质粒为第三代质粒包装系统，所述第三代质粒包装系统包括CAR转移质粒、包装质粒、VSV-G包膜质粒，所述CAR转移质粒、包装质粒、VSV-G包膜质粒的比例为10:3:1～1:3:2。

2.根据权利要求1所述慢病毒载体的制备方法，其中，所述接种到工厂化培养装置最终按0.02×10⁵～5×10⁴的浓度接种，所述工厂化培养装置包括多层超级细胞培养。

3.根据权利要求1所述慢病毒载体的制备方法，其中，所述步骤(4)收集细胞培养的上清液优选来自慢病毒转染真核细胞48和72小时两个时间点的培养物的上清液。

4.根据权利要求1所述慢病毒载体的制备方法，其中所述步骤(5)上清液的预处理的方式包括滤膜过滤；或其中所述步骤(6)浓缩纯化病毒包括超速离心。

5.根据权利要求1所述慢病毒载体的制备方法，其中

所述阳离子聚合物包括树枝状聚合物(Dendrimers)和聚乙烯亚胺(Polyethylenimine,PEI)；或

所述阳离子聚合物选自树枝状聚合物(Dendrimers)和聚乙烯亚胺(Polyethylenimine,PEI)。

6.根据权利要求7所述慢病毒载体的制备方法，其中，所述PEI包括支化的聚乙烯亚胺(BPEI)、线型聚乙烯亚胺(LPEI)和树枝状聚合物聚乙烯亚胺或所述PEI选自支化的聚乙烯亚胺(BPEI)、线型聚乙烯亚胺(LPEI)和树枝状聚合物聚乙烯亚胺中的任一种。

7.一种采用权利要求1所述的制备方法获得的病毒转染真核细胞的方法。

8.权利要求1所述的制备方法获得的慢病毒。

9.权利要求1所述的制备方法在改善慢病毒质量指标中的应用，其中，所述质量指标包括产率，转导能力和稳定性，所述稳定性包括不同温度条件下的稳定性、反复冻/融稳定性。

10.一种采用权利要求1所述的方法制备的病毒在基因治疗和真核生物药物基因工程中的应用。