[发明专利]一种慢病毒制备方法

说明书

本申请涉及病毒生物技术领域，具体公开了用于真核细胞转染的慢病毒载体的制备和储存技术，其包括步骤293T细胞的培养、病毒包装质粒的转染步骤真核细胞的培养、病毒包装质粒的转染、转染后培养、收集细胞培养的上清液、上清液的预处理、浓缩纯化慢病毒、重悬于病毒缓冲液制剂中冷冻储存，其转染采用阳离子聚合物法。本发明的慢病毒载体的制备和储存技术从病毒制备质粒转染、病毒纯化方法以及病毒存储几个方面着手，致力于病毒稳定性和活性的保持以及提高。本发明对病毒制剂优化后的制剂其病毒稳定性明显优于传统的制剂，所保存的慢病毒载体在对制剂不同时间不同温度反复冻融的稳定性较为理想，可考虑推广应用。

技术领域：

本发明属于病毒生物技术领域，更具体地涉及一种用于真核细胞转染的慢病毒载体的制备和储存方法。

背景技术

近年来随着对于造成癌症发病和持续的分子机理认识的不断加深以及基因转运载体的发展推动着基因治疗技术不断进步，其中基因治疗应用的载体之一的慢病毒载体(LVs)成为基因疗法中相对比较新的成员。已经它们被证明在包括癌症基因疗法的多种不同的应用中非常有效，能稳定地将其荷载整合进靶细胞的基因组，这样就能达到感兴趣基因的持续表达。此外慢病毒载体(LVs)有三个显著的特性，首先，慢病毒载体可以容纳高达10kb大小的基因；其次，慢病毒载体在宿主细胞中选择较为“安全”的整合位点；再次，慢病毒载体可以转导分裂细胞和非分裂细胞。治疗性病毒载体的范例成为治疗人类疾病的越来越有效的范例媒介。

慢病毒载体的生产具有一定的挑战性。病毒的稳定性成为制约慢病毒生产的重要瓶颈。病毒载体的制备主要包括病毒包装质粒的转染、病毒纯化、病毒储存以及应用。在这些过程中，慢病毒载体容易被钝化，其感染能力的降低甚至于丧失，从而降低了病毒的质量和效果，因此，我们需要采取能够保证病毒稳定性以及活性的方法制备病毒，从而防止其感染能力的降低甚至于丧失。

发明目的

本发明的目的在于提供一种能够提高慢病毒产率，转导能力和稳定性的可操作性较强容易掌握的慢病毒载体制备方法，满足基因治疗领域不断发展的要求。

为达到上述目的，本发明所采用的技术方案如下：

1.一种慢病毒载体的制备方法，包括如下步骤：

(1)真核细胞的培养，(2)慢病毒载体包装生产；(3)病毒包装质粒的转染，(4)转染后培养，(5)收集细胞培养培养物，固液分离取液体部分，(6)液体部分的预处理，(7)浓缩纯化慢病毒；(8)在病毒缓冲液制剂中冷冻储存；其中，

所述步骤(1)293T细胞的培养包括细胞复苏，扩大培养后接种到工厂化大规模培养装置；

所述步骤(2)慢病毒载体包装生产是采用第三代病毒包装质粒系统进行CAR慢病毒载体包装生产，

所述步骤(3)转染的方法优选阳离子聚合物基因转染法；

所述步骤(4)转染后培养是包装转染后将真核细胞接种到工厂化大规模培养装置；

所述步骤(5)收集细胞培养的液体部分包括不同培养时间的上清液；

所述步骤(6)液体部分的预处理的方式包括滤膜过滤；

所述步骤(7)浓缩纯化病毒包括超速离心。

所述细胞培养包括细胞复苏，扩大培养和工厂化大规模培养三个阶段。所述细胞复苏阶段和扩大培养阶段可以在细胞培养瓶中培养。所述大规模工厂化生产阶段可采用多层超级细胞工厂培养装置。

在一具体实施例中，细胞复苏至T75细胞培养瓶，48小时后扩大至T175培养方瓶，最终按生产要求细胞以1×105cells/cm2，接种至12层HyperStack超级细胞工厂(Corning，货号3270)，培养基为DMEM(Gibco)+10％FBS(Gibco)。接种的细胞比例对大规模细胞培养的生长率有重要影响。