[发明专利]一种改进的反转录microRNA的方法

说明书

本发明属于分子检测领域，具体地，涉及一种改进的反转录microRNA的方法。本发明采用不同于以往茎环法专门反转录miRNA所用的酶，采用普通mRNA或总RNA反转录所用的酶，改进反应步骤与方法，大大降低茎环法的高成本及反转录时间，提高检测效率、缩短检测周期、降低检测成本，实现快速、高效、微量反转录microRNA。

技术领域

本发明属于分子检测领域，具体地说，是一种改进的反转录microRNA的方法。

背景技术

microRNA(miRNA)是一类长17～22个核苷酸的小分子RNA，通过与靶基因3'非翻译区结合，在转录后水平抑制基因的表达。自1993年首次发现lin-4和let-7这2种miRNA以来，已有超过193个物种中的21264种miRNA在miRBase database内注册。研究预测，在人体内有大概超过60％的蛋白质编码基因受miRNA调控，这些蛋白参与了细胞周期、发育、分化和新陈代谢等多种生物学过程，miRNA对生理活动具有重要的调控作用。要了解miRNA在基因表达调控中所扮演的角色，就要对其表达进行快速、准确和定量的分析。传统的miRNA检测技术有northern hybridization和microarray，但是这种方法对于表达量较低的miRNA灵敏度低。基于qRT-PCR(Quantitative reverse transcription PCR)原理开发的茎环引物反转录法、poly-A加尾法，以及Tagman探针qRT-PCR检测法等。其中Tagman探针qRT-PCR检测法、茎环引物反转录法采用特异的茎环引物及反转录酶，相比于加尾法有很强的灵敏度与特异性，但是这两种方法存在的主要问题是成本高，反转录时间长。

中国专利2014100670446公开一种改进的茎环引物qRT-PCR检测miRNA的方法，包括：(1)miRNA检测引物的设计：茎环引物包括两部分，通用的茎环序列和与靶标miRNA3’端互补配对的特异引物序列，其中与靶标miRNA互补配对的碱基数为11bp；qPCR的下游引物针对通用的茎环序列，上游引物针对靶标miRNA的5’端；在所述上游引物的5’末端增加GC尾巴，以使上下游引物的退火温度相近；(2)将靶标miRNA反转录成cDNA；(3)定量PCR扩增，该方法特异性好、灵敏性高，只需合成一种下游引物，大大节约了成本。现有技术中，关于本发明反转录microRNA的方法，目前还未见报道。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种改进的反转录microRNA的方法，通过采用普通mRNA反转录酶，改进反应步骤与方法，可大大降低茎环法的高成本及反转录时间。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：

一种改进的反转录microRNA的方法，采用mRNA反转录酶，按照如下反转录体系进行反转录：