[发明专利]一种酶促变温高通量制备葡萄糖基甜菊糖苷的方法

说明书

本发明公开了一种酶促变温高通量制备葡萄糖基甜菊糖苷的方法，属于甜味剂生物合成技术领域。本发明用来源于Geobacillus sp.的环糊精葡萄糖基转移酶为催化剂，以甜菊糖苷为糖基受体，糊精或寡糖为糖基供体，以钙钡离子盐桥为主要稳定剂并联合甘油调整酶的构象和结合域开放度，变温分阶段利用淀粉酶的转苷和水解活性，从而以酶促变温高通量制备葡萄糖基甜菊糖苷。本发明技术可以提高酶的利用率，获得甜味和口感俱佳的葡萄糖基甜菊糖苷。

技术领域

本发明涉及一种酶促变温高通量制备葡萄糖基甜菊糖苷的方法，属于甜味剂的生物合成技术领域。

背景技术

甜菊糖苷是甜叶菊提取物中糖苷分子的总称；由具有甜味的亲水性糖基与疏水性的甜菊醇苷元组成，已鉴定出约40种衍生物。其中莱鲍迪苷A(RebaudiosideA，RA)、Rebaudioside D和Rebaudioside M的味质口感较好，而斯替夫苷(Stevioside，St)、莱鲍迪苷C和其它低分子量甜菊糖苷却带有一定的轻微苦味或甘草余味，这种微苦余味降低了它作为天然甜味剂的品质。甜菊醇口感味质极差，具有严重的苦涩余味，这便赋予甜菊糖苷轻微苦味的特性。因此，除了具有苦味的杂质对甜菊糖苷口感味质有影响外，甜菊糖苷自身的分子结构是产生苦涩余味的重要因素。对甜菊糖苷口感进行改善可从苦味产生的原因出发，一方面除去疏水性苦味杂质，提高甜菊糖苷的纯度，尤其是提高味质甜度最好的RA的含量；另一方面是从分子结构上对甜菊糖苷进行改性，利用酶法糖基化等方法引入糖基对其口感味质进行改善。在甜菊糖苷上嫁接其它基团使外围基团远离甜菊醇苷元，就有可能改善其后苦味；比如对甜菊糖苷进行适度的糖苷化。甜菊糖苷的糖基化或称接枝改性包括化学催化、酶催化和全细胞催化。

用于甜菊糖苷接枝改性的酶主要是糖基转移酶，目前尤以环糊精葡萄糖基转移酶(环糊精葡萄糖基转移酶)为代表，也有少量关于葡萄糖苷酶、呋喃果糖苷酶和半乳糖苷酶的报道。

例如，采用来自嗜碱软性芽胞杆菌的环糊精葡萄糖基转移酶，反应10h后，经纯化得到9种产物，结构分析显示在C-13位和C-19位通过α-1,4糖苷键分别连接了1到3个葡萄糖基，而C-13位连接1个或2个葡萄糖基时，味质与St相比都已改善；当C-13位连接3个葡萄糖基时，甜度则下降(Fukunaga,1989)。Lobov等利用商业化的葡萄糖基酶筛选出普鲁兰酶(Pullulanase)和真菌淀粉酶(Biozyme L)，用于甜菊糖苷的转苷反应，分别得到三种产物；但反应所需时间较长且产物收率小于10％(Lobov,1991)。Abelyan用环糊精作为糖基供体，得到九种转糖基产物，其中两种葡萄糖基甜菊糖苷的甜味特性较好，但产率较低，产率之和为11.6％(Abelyan VA,2004)。Kochikyan用六种菌株生产出不同种类的环糊精葡萄糖基转移酶，以液化淀粉作为糖基供体催化甜菊糖苷转苷，得到七种转糖基产物(Kochikyan V T,2006)。Jaitak等首次将微波辅助手段应用于酶法改性甜菊糖苷，以β-环糊精作糖基供体，用来源于Bacillusfirmus的β-环糊精葡萄糖基转移酶在微波功率80W，反应温度50℃，pH7.0的磷酸缓冲液中反应，主要得到两种α-1,4-葡糖基衍生物，66％的4’-O-alpha-D-葡萄糖基斯替夫苷和24％的4”-O-alpha-D-麦芽糖基斯替夫苷，甜菊糖苷的苦涩味明显降低(Jaitak V,2009)。Yamamoto等用环糊精葡萄糖基转移酶催化甜菊糖苷进行α-l，6位的转糖基反应，甜菊糖苷和淀粉在环糊精葡聚糖酶的催化下反应4h，得到单取代和双取代的葡萄糖接枝产物，产率分别为35.7％和42.9％。等研究反应机理后推断造成α-l，6位的转糖基化作用弱于α-1，4位的转糖基化作用的原因是糖基受体上葡萄糖基的连接方式(Yamamoto K,1994)。佟树敏在50℃下以玉米淀粉作为糖基供体，加入β-环糊精葡萄糖基转移酶对甜菊糖苷进行酶法改性，反应48h后产率为35.5％(佟树敏,1998)。