[发明专利]一种CYFRA21-1磁微粒化学发光免疫定量检测试剂盒及其制备方法

权利要求书

1.一种CYFRA21-1磁微粒化学发光免疫定量检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：

1） CYFRA21-1校准品，浓度为1，5，20，100，300ng/mL；

2） 偶联有链霉亲和素的磁微粒悬浮液；

3） 生物素标记的CYFRA21-1抗体；

4）CYFRA21-1抗体酶结合物，所用的酶为辣根过氧化物酶，辣根过氧化物酶纯度RZ ≥3.0，活性≥ 250U/mL；

5） CYFRA21-1质控品；质控品包括浓度3ng/mL的低值质控品和200ng/mL的高值质控品；

6） 化学发光液A液和B液；A液为5mmol/L， pH8.6的Tris-HCl缓冲液，且该缓冲液中含有终浓度0.7g/L鲁米诺和终浓度0.08g/L对碘酚；B液为0.675g/L过氧化脲；

7） 20倍浓缩洗液；

8） 反应管。

2.根据权利要求1所述的CYFRA21-1磁微粒化学发光免疫定量检测试剂盒，其特征在于，所述的磁微粒是表面包裹带有氨基或羧基活性基团的四氧化三铁，粒径10-50nm。

3.根据权利要求1所述的CYFRA21-1磁微粒化学发光免疫定量检测试剂盒，其特征在于，所述的反应管的材料是透明聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯或玻璃。

4.一种制备所述权利要求1-3任一权利要求所述的试剂盒的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）CYFRA21-1校准品的配制：

将CYFRA21-1抗原用山羊血清配制成校准品浓储液，以国家校准品进行定标，将浓储液用山羊血清稀释至工作浓度，分别为1，5，20，100，300ng/mL；

（2）CYFRA21-1质控品的配制：

用山羊血清将上述浓储液分别稀释至3ng/mL和200ng/mL ，并以国家校准品进行定标；将3ng/mL作为低值质控品，200ng/mL作为高值质控品；

（3）磁微粒-链霉亲和素悬浮液的制备：

配制1L，方法如下：

取100mL0.1M MES缓冲液，加入10mg表面联有羧基的磁微粒，室温搅拌40min，之后加入3.5mg链霉亲和素，然后加入8mg/mLEDC溶液，2-8℃反应1h后，用0.01M PBS缓冲液洗涤3次，最后用0.01M PBS定溶至1L即可；

（4）生物素标记的CYFRA21-1抗体的制备

取0.5mg CYFRA21-1抗体，用硼酸盐缓冲液在2～8℃下透析1～3h；将透析后的抗体加入25ug生物素，同时加入二甲基亚砜，使二甲基亚砜最终质量浓度为5-10%，缓慢振荡，避光反应3h；在上述溶液中加入250uL1M 氯化铵溶液，常温避光反应30-60min；用0.01M PBS溶液在2～8℃下透析2天，期间换液3-5次；

（5）CYFRA21-1抗体酶结合物的制备

采用改良高碘酸钠氧化法将CYFRA21-1抗体与辣根过氧化物酶进行偶联后，用酶稀释液将其稀释至工作浓度1:5000-8000，并加入15%酶稳定剂，储存于2~8℃；

（6）20倍浓缩洗液的配制

20倍浓缩洗液包括58g/L 磷酸氢二钠，5.92g/L磷酸二氢钠，180g/L NaCl，10mL/LTween-20和2% Proclin300；

（7）化学发光液A液和B液的配制

A液为0.7g/L鲁米诺，0.08g/L对碘酚，缓冲液为pH8.6的5mmol/L Tris-HCl，避光保存；B液为0.675g/L过氧化脲，用工艺用水配制；A液和B液在使用前5min混合；

（8）组装：将上述试剂组装成盒，储存于2~8℃；

（9）对采用该方法制备的试剂盒进行物理检查，对准确度、剂量-反应曲线的线性、精密度、特异性、灵敏度、质控品的测定值和稳定性进行测定。