[发明专利]利用重测序技术快速确定转基因株系插入位点的方法

说明书

本发明公开了一种利用重测序技术确定转基因株系插入位点的方法，包括以下步骤：1)、提取转基因株系基因组DNA，总量至少2g；2)、进行基因组重测序，数据量至少12G；3)、利用转基因载体T‑DNA序列作为模板，对得到的测序数据进行比对分析，得到插入位点的信息；4)、根据插入位点的信息设计引物，进行PCR验证；从而确定每个转基因株系的插入位点。利用本发明的方法确定转基因株系插入位点具有方法成熟、简单，成功率高的特点，可以广泛应用于转基因株系的插入位点确定。

技术领域

本发明属于植物基因工程领域。具体的说，本发明涉及一种利用重测序技术快速确定转基因株系插入位点新方法。

背景技术

目前应用于侧翼序列分离的方法有很多，主要有SON-PCR、TAIL-PCR及接头-PCR等，最近又出现一种利用DNA捕获技术获得侧翼序列的方法。SON-PCR和TAIL-PCR是基于热不对称原理发明的PCR方法，这两种方法由于第二链合成的随机性，以及转基因株系大多不是单拷贝的缘故，造成引物匹配混乱，导致获得有用片段的效率不高；接头-PCR方法可以大大提高有效片段的获得，现已公布了三种接头-PCR获得侧翼序列的方法，但都存在一些缺点，如：有的方法采用平端连接接头，使得连接效率低，不利于后期的PCR扩增；有的方法虽然使用黏性末端接头，提高了连接效率，但可供选择的酶的种类有限，适用范围不广，通用性不高；利用DNA捕获技术获得侧翼序列的方法，操作要求高，步骤繁琐，对技术要求很高，导致成功率低。而侧翼序列的获得对目前植物转基因应用领域非常重要，迫切需要得到一种操作简单、步骤少、成功率高的方法。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种可靠、高通量和快速确定转基因株系插入位点的新技术，即，提供一种利用重测序技术确定转基因株系插入位点的方法。利用该技术确定转基因株系插入位点具有方法成熟、简单，成功率高的特点，可以广泛应用于转基因株系的插入位点确定。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种利用重测序技术确定转基因株系插入位点的方法，包括以下步骤：

1)、提取转基因株系(农杆菌介导的转基因株系)基因组DNA，总量至少2g；

2)、进行基因组重测序，数据量至少12G；

3)、利用转基因载体T-DNA序列作为模板，对得到的测序数据进行比对分析，得到插入位点的信息；

4)、根据插入位点的信息设计引物，进行PCR验证；从而确定每个转基因株系的插入位点。

作为本发明的利用重测序技术确定转基因株系插入位点的方法的改进：

步骤1)中提取基因组DNA的方法为CTAB法。

作为本发明的利用重测序技术确定转基因株系插入位点的方法的进一步改进：

所述步骤2)为：将步骤1)所得的基因组等比例混合后，按照常规基因组二代测序技术进行基因组的重测序，DNA建库长度200-300bp，每个Reads长度150bp，至少得到12G的数据。

作为本发明的利用重测序技术确定转基因株系插入位点的方法的进一步改进：

所述步骤3)中序列比对分析所用软件为bowtie2，默认设置。

作为本发明的利用重测序技术确定转基因株系插入位点的方法的进一步改进：

所述步骤3)为：以转基因载体序列(至少包含一个边界序列)为参考基因组进行同源性分析，根据分析的结果，提取一端匹配到载体序列，另一端未匹配的reads序列；未匹配的reads序列以水稻基因组序列，采用blast软件进行同源性比对分析，根据比对结果设计引物进行后续验证。

作为本发明的利用重测序技术确定转基因株系插入位点的方法的进一步改进：