[发明专利]一种鮟鱇鱼骨抗肿瘤十二肽的制备方法及应用

权利要求书

1.一种鮟鱇鱼骨抗肿瘤十二肽的制备方法，它选用鮟鱇鱼骨作为原料，其特征在于所述的制备方法包括如下步骤：

a）碎料：用高速组织捣碎机将鮟鱇鱼骨进行捣碎处理，制成粉状和微颗粒状的鮟鱇鱼骨粉；

b）酶解：选用中性蛋白酶对鮟鱇鱼骨粉进行酶解，制成鮟鱇鱼骨粉酶解液；

c）超滤：将鮟鱇鱼骨粉酶解液加入超滤系统，用10KD、5KD、3KD的超滤膜进行超滤，收集>10KD、10-5KD、5-3KD和<3KD分子量的酶解液，进行冷冻干燥，

d）鮟鱇鱼酶解液过G-25洗脱液得到5个峰，经体外抗肿瘤实验筛选，峰2和峰3具有最高的抗肿瘤活性的，收集峰2和峰3，冷冻干燥，进一步分离纯化并用高效液相纯度检测；

e）经过反相高效液相色谱( RT-HPLC)纯化及氨基酸序列检测：峰3用HPLC检测发现，该分子段只有1个洗脱峰，并进行氨基酸序列检测，其氨基酸序列为Met-Trp- Ile-Phe-His-Asp-Ser-Asp- Lys-Asn- Cys- Arg；制成鮟鱇鱼骨抗肿瘤十二肽产品。

2.根据权利要求1所述的鮟鱇鱼骨抗肿瘤十二肽的制备方法，其特征在于：

所述的步骤b）酶解条件为：pH:7.0-7.5，温度：40-45℃，料液比：1:1，时间：5-7h, 加酶量:1200-1500 u/g；

所述的步骤d）中，所述G-25凝胶分离是：将步骤c）获得的酶解液用蒸馏水进行溶解，离心，取上清液，过0.45μm微孔滤膜，取酶解液溶液1.5ml过Sephadex G-25柱(90cm×115cm(ID))，用蒸馏水为洗脱液，平衡和洗脱；每管收集3ml，于λ280 nm 处检测，收集各峰洗脱液；

所述的步骤e）中，所述反相高效液相色谱( RT- HPLC)是：即用RT-HPLC进行纯化，色谱条件: 1)样品前处理:将样品用0.06%TFA的水溶解到0.6ml，离心（12000-14000 RPM，离心10分钟）取上清；2)系统: Agilent 1260 HPLC；3)柱子:ZorbaxSB-C18 4.6X250 5um；4)进样体积:80-100ul；5)缓冲液、平衡缓冲液: 0.06%TFA洗脱缓冲液: 0.05%TFA的乙腈；6) 梯度:0%–0 % B洗脱4分钟，0%–8% B洗脱25分钟，8%-100%B洗脱1分钟，100% -100%B洗脱5分钟；7)流速:1.0 ml/min；8）检测:280nm/214nm。

3.一种如权利要求1或2所述鮟鱇鱼骨抗肿瘤十二肽的应用，其特征在于所述的鮟鱇鱼骨抗肿瘤十二肽作为功能食品，用于前列腺癌患者的辅助功能性食品，对前列腺癌的抑制作用明显。