[发明专利]一种鮟鱇鱼骨抗肿瘤十二肽的制备方法及应用

说明书

一种鮟鱇鱼骨抗肿瘤十二肽的制备方法及应用，它选用鮟鱇鱼骨作为原料，所述方法包括：a）碎料：用高速组织捣碎机将鮟鱇鱼骨进行捣碎处理，制成粉状和微颗粒状的鮟鱇鱼骨粉；b）酶解：选用中性蛋白酶对鮟鱇鱼骨粉进行酶解，制成鮟鱇鱼骨粉酶解液；c）超滤：将鮟鱇鱼骨粉酶解液加入超滤系统，用10KD、5KD、3KD的超滤膜进行超滤，收集>10KD、10‑5KD、5‑3KD和<3KD分子量的酶解液，进行冷冻干燥。

技术领域

本发明涉及的是一种鮟鱇鱼骨抗肿瘤十二肽的制备方法及应用，尤其是一种对前列腺癌细胞具有抑制作用的鮟鱇鱼骨抗肿瘤十二肽的制备方法及应用。

背景技术

传统的治疗手段主要包括前列腺癌根治切除术、激素治疗、化疗、放射治疗等，但治疗后癌症很难根除，复发率极高。因此，从海洋中寻找一种高效、低毒和具有较强特异性的新型抗肿瘤药物具有重要的研究意义和临床意义。

在水产品加工过程中，会产生大量的下脚料（包括 鱼头、鱼皮、鱼鳍、鱼尾、鱼骨及其残留鱼肉），其质量约占原料鱼的30%～55%，不同部位胶原蛋白的含量从20%～50%不等。鮟鱇鱼（Lophius litulon）属冷温性底层鱼类，常栖伏海底，分布于北太平洋西部，我国产于东海北部、黄海及渤海。近年来我国鮟鱇鱼出口需求旺盛，产量和价格大幅增加，鮟鱇鱼出口己成为我国的新兴渔业。然而，在鮟鱇鱼的加工中，大量鱼皮被作为下脚料而废弃，这不仅污染了环境，也造成了资源的浪费。目前，为了提高鮟鱇鱼皮的经济附加值，已有学者开始研究从鮟鱇鱼加工副产物中提取硫酸皮肤素、硫酸 软骨素、胶原蛋白等。

活性肽是由两个或两个以上的氨基酸以肽键相连的化合物，在人体内起重要生理作用，发挥生理功能，如：调节体内的水分、电解质平衡；促进伤口愈合；修复细胞、改善细胞代谢，能起到防癌作用等。活性肽一般通过酶解生物活性材料获得，研究发现食物蛋白通过蛋白酶酶解方式，可以得到功能多样的活性多肽。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术存在的不足，而提供一种通过蛋白酶对鮟鱇鱼鱼骨进行酶解以获得一种对前列腺癌细胞具有抑制作用的、提取的多肽得率高的鮟鱇鱼骨抗肿瘤十二肽的制备方法及应用。

本发明的目的是通过如下技术方案来完成的，一种鮟鱇鱼骨抗肿瘤十二肽的制备方法，它选用鮟鱇鱼骨作为原料，所述的制备方法包括如下步骤：

a）碎料：用高速组织捣碎机将鮟鱇鱼骨进行捣碎处理，制成粉状和微颗粒状的鮟鱇鱼骨粉；

b）酶解：选用中性蛋白酶对鮟鱇鱼骨粉进行酶解，制成鮟鱇鱼骨粉酶解液；

c）超滤：将鮟鱇鱼骨粉酶解液加入超滤系统，用10KD、5KD、3KD的超滤膜进行超滤，收集&gt;10KD、10-5KD、5-3KD和&lt;3KD分子量的酶解液，进行冷冻干燥，

d）鮟鱇鱼酶解液过G-25洗脱液得到5个峰，经体外抗肿瘤实验筛选，峰2和峰3具有最高的抗肿瘤活性的，收集峰2和峰3，冷冻干燥，进一步分离纯化并用高效液相纯度检测；

e）经过反相高效液相色谱( RT-HPLC)纯化及氨基酸序列检测：峰3用HPLC检测发现，该分子段只有1个洗脱峰，并进行氨基酸序列检测，其氨基酸序列为Met-Trp- Ile-Phe-His-Asp-Ser-Asp- Lys-Asn- Cys- Arg；制成鮟鱇鱼骨抗肿瘤十二肽产品。

作为优选：所述的步骤b）酶解条件为：pH:7.0-7.5，温度：40-45℃，料液比：1:1，时间：5-7h, 加酶量:1200-1500 u/g；

所述的步骤d）中，所述G-25凝胶分离是：将步骤c）获得的酶解液用蒸馏水进行溶解，离心，取上清液，过0.45μm微孔滤膜，取酶解液溶液1.5ml过Sephadex G-25柱(90cm×115cm(ID))，用蒸馏水为洗脱液，平衡和洗脱；每管收集3ml，于λ280 nm 处检测，收集各峰洗脱液；