[发明专利]一种脂氧酶以及7S球蛋白双缺失的大豆新种质的建立方法

权利要求书

1.一种脂氧酶以及7S球蛋白双缺失的大豆新种质的建立方法，其特征在于，包括以下步骤：

(一)利用改良的聚丙烯酰胺凝胶电泳方法从大豆种质中筛选获得7S球蛋白的α、α'与β三个亚基同时缺失的大豆品种；

所述的改良的聚丙烯酰胺凝胶电泳方法，按照以下步骤进行：

(1)痕量取样：采用半粒切取法或者垂直钻取法进行取样；

1)半粒切取法：用裁纸刀片在大豆种脐相反侧，用刀片逐粒纵向切取5-8mg子叶粉末，并按顺序逐粒放入96孔板，加盖，5℃低温保存待分析，保存时间若超过2周，放入-20℃冷冻保存；

2)垂直钻取法：以钻头的牙科用打磨钻，替代裁纸刀片，垂直于子叶正面，钻取子叶粉末5-8mg，按顺序逐粒放入96孔板，加盖，5℃低温保存待分析，保存时间若超过2周，放入-20℃冷冻保存；

(2)种子摆放方法：为了确保取样后的种子与其取样样品检测结果的准确对应，取样后的待确认种子摆放顺序，须与样品放入96孔板顺序及用12道微量移液器上样电泳的顺序完全保持一致，待检测结束后，根据检测结果，可以直接找到目标种子；

(3)试剂配制

A液：Tris：363g；SDS：4g，用HCl调pH至8.8，定容至1000ml；

B液：Tris：30g；SDS：4g，用HCl调pH至6.8，定容至1000ml；

C液：丙烯酰胺：300g；双丙烯酰胺：8g，定容至1000ml；

E液：核黄素：8mg，定容至1000ml；

P液：过硫酸铵：7.5g，定容至500ml；

染色液：冰乙酸：200ml；甲醇：900ml；G250：5g，定容至3000ml；

脱色液：冰乙酸：150ml；甲醇：600ml，定容至3000ml；

蛋白质提取液：Tris：6.057g；溴酚蓝：20g；甘油：30g；β-巯基乙醇20g，用HCl调pH至8.0，定容至1000ml；

10×电泳缓冲液：Tris：30g；SDS：10g；甘氨酸：144g，定容至1000ml；

(4)样品前处理方法

将步骤(1)得到的子叶粉末放入规格为8×12方格的样品盒中，用排枪在每个方格中加入500μl的蛋白提取液，振荡1min，随后超声萃取8min，室温下静置30min，再次振荡混匀后，5000rmp离心5min，最后取10μl上清液用于聚丙烯酰胺凝胶电泳；

(5)电泳胶板的制备

1)分离胶的制备：以制作4枚规格为14cm×13cm×1mm厚、浓度为6.75％的聚丙烯酰胺凝胶为例：按先后顺序依次将A液18.0ml，C液15.6ml，P液3.6ml，蒸馏水34.8ml加入200ml的锥形瓶中，一边加一边摇晃，最后加入48μl的TEMED；

2)浓缩胶的制备

按先后顺序依次将B液6.4ml，C液4.0ml，P液0.8ml，E液5.2ml，蒸馏水7.6ml加入100ml的三角瓶中，边加边摇晃，最后加入24μl的TEMED；

(6)ISDS-PAGE凝胶电泳

接通电泳仪的电源，打开连接电泳槽的冷凝水，以120V电压电泳1h，之后换180V电压电泳3.5-4h，电泳结束后，将做好标记的分离胶放入染色液中，轻摇染色1.5-2h，之后取出放入脱色液中，轻摇脱色4h以上，之后将胶板取出放入装有蒸馏水的塑料盒中，放置在荧光灯箱上面观察7S球蛋白亚基的缺失状况，并用凝胶成像仪扫描分析；

(二)以脂氧酶三个同工酶同时缺失的东富豆3为母本，以7S球蛋白的α、α'与β三个亚基同时缺失的大豆品种为父本配置杂交组合；利用经改良的聚丙烯酰胺凝胶电泳方法，按照步骤(1)-(6)在F1代进行杂合体检测，确认所获得的F1种子，均表现为7S球蛋白α、α'与β三个亚基缺失，但脂氧酶均不缺失性状，F1种子经海南南繁加代，收获F2种子，再利用改良的聚丙烯酰胺凝胶电泳方法，按照步骤(1)-(6)对F2分离世代种子通过痕量取样检测法，进行7S球蛋白α、α'与β三个亚基与脂氧酶缺失检测，获得脂氧酶三个同工酶以及7S球蛋白α、α'与β三个亚基同时缺失的大豆新种质。