[发明专利]一种应用KASP技术进行高通量转化体特异性检测的方法

说明书

本发明提供了一种基于KASP(竞争性等位基因PCR)技术的高通量转化体特异性检测的方法，所述检测方法包括如下步骤：(1)设计转化体靶标序列的引物及内源基因的引物；(2)提取样品的DNA；(3)利用转化体靶标序列的引物、内源基因的引物、KASP反应液以及样品DNA，进行PCR反应，判断样品是否含有转化体的成分。利用本方法对植物样品进行转化体特异性检测具有高通量、低成本、高准确率以及易于操作等优点。

技术领域：

本发明涉及分子生物学领域，具体的，涉及一种利用KASP技术进行高通量转化体特异性检测的方法。

背景技术：

对转基因作物及其产品的分子检测是转基因生物安全管理的基础。我国目前进口的转基因原料包括玉米、大豆、油菜等多种作物的几十种转化体，有相当一部分转化体由于尚未通过国家相关部门的批准，因此暂时不能进口。转化体特异性检测至少有三方面的作用：第一，转化体特异性的检测能预防未经批准的转化体的进口，有利于我们国家对进口的转基因作物及其产品进行有效的监管；第二，转化体特异性的检测是进行转基因品种真实性检测手段之一；第三，如果需要对产品中转基因成分进行定量检测，需要先通过转化体特异性检测确定产品含有转化体的种类。

目前常用的转化体的检测方法有基于样品DNA和基于样品蛋白质的检测方法。基于DNA的检测方法包括普通PCR和实时荧光PCR等，前者检测成本低，但是操作繁琐；后者的检测灵敏度高，但是检测费用昂贵。两者共同的缺点是通量低，很难对大批量样品进行高效的检测。基于蛋白质的检测方法包括酶联免疫吸附测定法和转基因快速检测试纸条，他们的优点是简便而且快速，缺点在于他们无法区分表达相似蛋白的转基因品系,无法检测蛋白已经变性的样品，另外抗体的研发以及实验体系的建立比较复杂，造成前期的成本高。总之，依靠上述常规的方法，很难实现对植物样品进行高通量且低成本的转化体特异性检测。

竞争性等位基因PCR(kompetitive allele specific PCR，KASP)是一种基于荧光检测的基因分型技术。进行检测的时候，每个反应孔采用双色荧光(一般是FAM荧光和HEX荧光)检测样品基因组上某一位点可能的两种基因型。该技术现阶段主要被应用于SNP基因分型研究中，成为分子辅助育种、性状基因的精细定位、以及种子资源鉴定的主要技术手段。

然而，目前尚未见利用KASP技术对转基因作物进行转化体特异性检测的报道。

发明内容：

有鉴于此，提出本发明。

KASP技术被研究者广泛应用于SNP基因分型等的研究中，通过对一段含有SNP位点的基因序列设计不同引物来进行SNP分型，而并未见将KASP技术应用于转化体特异性检测的报道。本发明的发明人设计转化体靶标序列的引物及内源基因的引物，并利用KASP技术来检测样品是否含有转基因成分，极大地提高了转基因检测的效率。

与KASP技术应用于SNP分型不同，将KASP应用于转化体特异性检测时需要在反应中加入转化体靶标序列的引物和内源基因的引物，如何保证两对引物之间没有互相干扰成为本应用的一个难点。另外在进行大批量样品检测的时候，如何确保检测结果的准确性也是本应用的一个难点。

本发明中，发明人经大量尝试，确定了农作物的内源基因和一些常见转化体靶标序列的引物的优良组合。通过该发明的方法,不仅可以检测样品是否含有转化体，同时可以验证该反应是否正确进行(如果没有内源基因的检测信号，则证明此次反应没有正确进行)，显著提高了检测的效率。

具体的，本发明的技术方案如下：

本发明提供了KASP技术在检测转化体的应用。其特征在于，所述检测方法包括如下步骤：(1)设计转化体靶标序列的引物及内源基因的引物；(2)提取样品的DNA；(3)利用转化体靶标序列的引物、内源基因的引物进行检测，判断样品是否含有该转化体的成分。