[发明专利]一种利用昆虫几丁质酶降解固体几丁质生产N-乙酰氨基葡萄糖的方法

说明书

本发明公开一种利用昆虫几丁质酶降解固体几丁质生产N‑乙酰氨基葡萄糖的方法，所述方法是使用晶态的固体几丁质为底物进行水解，所述水解使用的复合酶为终浓度0.3mg/mL的几丁质酶H和终浓度0.06mg/mL的几丁质酶I；还可以加入终浓度0.06mg/mL的β‑N乙酰己糖胺酶1。本发明所述方法还包括对固体几丁质的前处理步骤，即对固体几丁质进行破碎后作为生产N‑乙酰氨基葡萄糖的底物，通过铁氰化钾法测定单糖产物量，所述复合酶对固体几丁质底物的降解，能够在5小时实现底物超过81％的转化，具有很好的工业化应用前景。

技术领域

本发明涉及一种利用昆虫几丁质酶降解固体几丁质生产N-乙酰氨基葡萄糖的方法。

背景技术

几丁质又名甲壳质或壳多糖，是由N-乙酰氨基葡萄糖通过β-1,4糖苷键结合起来的聚合物。自然界中，几丁质是年产量最高的含氮多糖类物质，约为100亿吨，是重要的生物质资源。几丁质是虾、蟹等节肢动物外骨骼的重要成分，在渔业生产过程中被作为废弃物而得不到有效的利用。其降解产物氨基糖类可广泛应用于医药、食品、农业等领域，具有重达的经济价值和社会价值。几丁质能通过化学法和生物酶法被降解，而目前常用的化学降解法消耗大量强酸强碱，对环境污染巨大，且反应效率低，产品的成分复杂、质量差，已逐步被生物酶法降解几丁质取代。

采用生物酶法降解几丁质的一个主要问题在于固体几丁质天然条件下以晶态的致密形式存在，其内部分子之间存在大量的氢键，使得生物酶在降解几丁质时效率非常低，限制了几丁质为生物质能源的应用。目前降解几丁质的方法，所使用的几丁质酶大多来源于微生物，却未见任何应用昆虫几丁质酶降解几丁质生产N-乙酰氨基葡萄糖的方法。而且目前降解几丁质的方法中很少明确是使用晶态的固体几丁质为底物进行水解，因晶态几丁质相比非晶态的几丁质与更难被水解，水解效率相对较低。

发明内容

针对几丁质降解过程存在的问题，本发明应用昆虫几丁质降解系统，再辅助以物理的方法将固体几丁质变成小的晶态纤维，实现几丁质短时间内的高效水解。本发明的目的在于提供了一种物理方法前处理固体几丁质，并利用昆虫中发现的几丁质酶H水解处理后的几丁质，实现短时间降解几丁质，生产N-乙酰氨基葡萄糖的方法。反应过程成分简单，条件温和，易于产物的分离及反应过程的实现。本发明采用的具体技术方案为：

一种利用昆虫几丁质酶降解固体几丁质生产N-乙酰氨基葡萄糖的方法，所述方法是使用固体几丁质为底物进行水解，所述水解使用的复合酶为：终浓度0.3mg/mL的几丁质酶H和终浓度0.06mg/mL的几丁质酶I；优选的情况下，还可以加入终浓度0.06mg/mL的β-N乙酰己糖胺酶1。

本发明中所述的固体几丁质，又称α-几丁质(Sikorski et al.,Biomacromolecules 2009,10,1100-1105)，是指主要为结晶状态的固体颗粒状几丁质。几丁质微丝之间以反相平行排列，链与链之间存在氢键紧密堆叠，结构致密，不易于几丁质酶水解。与结构松散的，不含致密结构的胶体几丁质有很大差别。

实际应用过程中，本领域技术人员可以根据自身实验条件，选择合适的基因表达载体，表达和制备前文所述的三种酶。进一步的，在本发明中，所述昆虫几丁质酶的获得是利用现有的毕赤酵母工程菌株，分别表达昆虫几丁质酶H，几丁质酶I和β-N乙酰己糖胺酶1，再从酵母发酵液上清中分离得到相应的重组蛋白。更为具体的，所述分离是通过金属螯合层析从酵母发酵液上清中分离得到相应的重组蛋白。

进一步的，在上文利用昆虫几丁质酶降解固体几丁质生产N-乙酰氨基葡萄糖的方法中，所述几丁质酶H为昆虫来源的几丁质酶Chi-h；所述的几丁质酶I和β-N乙酰己糖胺酶1分别为昆虫来源的几丁质酶ChtI和Hex1。