[发明专利]一种鹿茸干细胞的制备方法、鹿茸干细胞及其应用

权利要求书

1.一种鹿茸干细胞的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：1.鹿茸间充质组织取材；2.鹿茸间充质干细胞原代培养；3.鹿茸间充质干细胞的纯化。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述步骤1.鹿茸间充质组织取材具体为：

(1)取生长期10-70天的鹿茸，无菌纱布去除鹿茸表面的灰尘及血污，备皮后用75％酒精进行消毒处理；

(2)在超净工作台中，用一次性无菌组织切片刀片切下3-5cm厚的鹿茸尖端组织，置于无菌培养皿中，然后沿纵向将其分割为0.5-1cm厚的薄片，舍弃最外侧的两片其余保留；

(3)将步骤(2)保留的薄片平放于无菌培养皿中，用刀片刮去表面血污后，沿着皮肤下结缔组织将皮层和皮下组织分割开来，取皮下组织中微微凸起的弧形半透明样组织，厚度5-8mm，此半透明组织即为鹿茸间充质层；

(4)利用手术刀将间充质层组织块分别切割成0.2mm×0.2mm×0.2mm规格，用含哌拉西林10ug/ml,环丙沙星10ug/ml的PBS缓冲液反复冲洗，直至血污完全去除。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述步骤2.鹿茸间充质干细胞原代培养具体为：

(1)将步骤1所得组织每2-5g，放入40ml含双抗的DMEM培养基中后，再加入7-8ml 50U/ml的Ⅱ型胶原酶溶液，37℃孵育10-25min；

(2)1000rpm离心5min，弃去上清液，按步骤(1)中组织每2-5g加入10mlDMEM完全培养基，混匀，重复本步骤1次，1000rpm离心5min，弃去上清液；

(3)将步骤(2)所得组织块铺在75cm²培养瓶中，加入5ml DMEM完全培养基，倒置放入CO₂培养箱中进行培养，培养条件为37℃，5％(v/v)CO₂，4-5h后将培养瓶翻转过来，加入10mlDMEM完全培养基继续培养，培养条件不变；

(4)待细胞长满培养瓶底部得到鹿茸间充质干细胞的原代细胞。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述步骤3.鹿茸间充质干细胞的纯化具体为：将步骤2.得到的鹿茸间充质干细胞的原代细胞经过以下步骤中的任意一步或两步以上操作后，得到纯化干细胞：

(1)用间充质干细胞的标记因子CD9,的单克隆抗体对培养的细胞进行免疫荧光染色；用流式细胞仪检测阳性细胞的比例，并利用流式细胞仪将CD9阳性细胞分离出来；

(2)用间充质干细胞的标记因子CD90的单克隆抗体对培养的细胞进行免疫荧光染色；用流式细胞仪检测阳性细胞的比例，并利用流式细胞仪将CD90阳性细胞分离出来；

(3)用间充质干细胞的标记因子CD105的单克隆抗体对培养的细胞进行免疫荧光染色；用流式细胞仪检测阳性细胞的比例，并利用流式细胞仪将CD105阳性细胞分离出来；

(4)用间充质干细胞的标记因子CD73的单克隆抗体对培养的细胞再次进行免疫荧光染色；用流式细胞仪检测阳性细胞的比例，并利用流式细胞仪将CD73阳性细胞分离出来；

(5)用间充质干细胞的标记因子Stro-1的单克隆抗体对培养的细胞再次进行免疫荧光染色；用流式细胞仪检测阳性细胞的比例，并利用流式细胞仪将Stro-1阳性细胞分离出来。