[发明专利]一种鹿茸干细胞的制备方法、鹿茸干细胞及其应用

说明书

本发明提供一种鹿茸干细胞的制备方法、鹿茸干细胞及其应用，属于组织工程技术领域。为解决现有技术制备的鹿茸干细胞普遍存在纯度不高、成骨/成软骨及成脂分化潜能低、全皮层缺损治疗效果不好等问题，本发明提供的方法包括：1.鹿茸间充质组织取材；2.鹿茸间充质干细胞原代培养；3.鹿茸间充质干细胞的纯化。纯化后鹿茸间充质干细胞具有更强的成骨，成软骨及成脂分化潜能；纯化后鹿茸间充质干细胞制备的条件培养液具有更强、批次间更稳定的皮肤损伤治疗效果。

技术领域

本发明属于组织工程技术领域，具体涉及一种鹿茸干细胞的制备方法及应用。

背景技术

鹿茸是唯一可以完全再生的哺乳动物器官，且鹿茸的生长速度可以达到2cm/天。鹿茸的生长由鹿茸尖部的生长中心所驱动，其中富含间充质样干细胞，该干细胞可以分泌多种生长因子。现有技术公开了鹿茸(deer antler)组织的性质，该组织被公认为哺乳动物组织中最快速生长的骨形式。已进行了许多尝试来利用该组织的增殖特性，特别是通过分离生长因子。申请W093/19085公开了分离生长因子(其为能够再生受损骨组织的物质)的方法。公开了获得从日本鹿(梅花鹿(Cervus nippon))的茸角分离的提取物的方法，所述提取物刺激造血干细胞和巨核细胞的增殖。申请WO2004/112806公开了用于治疗神经元障碍的、由获自鹿茸的生长激素标志物产生的组合物。但现有技术制备的鹿茸干细胞普遍存在纯度不高、成骨/成软骨及成脂分化潜能低、全皮层缺损治疗效果不好等问题。

发明内容

为解决上述现有技术制备的鹿茸干细胞普遍存在纯度不高、成骨/成软骨及成脂分化潜能低、全皮层缺损治疗效果不好等问题，本发明提供一种新的鹿茸干细胞的制备方法、鹿茸干细胞及其应用。

本发明提供的鹿茸干细胞的制备方法技术方案为：

包括以下步骤：

1.鹿茸间充质组织取材；2.鹿茸间充质干细胞原代培养；3.鹿茸间充质干细胞的纯化。

所述步骤1.鹿茸间充质组织取材具体为：

(1)取生长期10-70天的鹿茸，无菌纱布去除鹿茸表面的灰尘及血污，备皮后用75％酒精进行消毒处理；

(2)在超净工作台中，用一次性无菌组织切片刀片切下3-5cm厚的鹿茸尖端组织，置于无菌培养皿中，然后沿纵向将其分割为0.5-1cm厚的薄片，舍弃最外侧的两片其余保留；

(3)将步骤(2)保留的薄片平放于无菌培养皿中，用刀片刮去表面血污后，沿着皮肤下结缔组织将皮层和皮下组织分割开来，取皮下组织中微微凸起的弧形半透明样组织，厚度5-8mm，此半透明组织即为鹿茸间充质层；

(4)利用手术刀将间充质层组织块分别切割成0.2mm×0.2mm×0.2mm规格，用含哌拉西林10ug/ml,环丙沙星10ug/ml的PBS缓冲液反复冲洗，直至血污完全去除。

所述步骤2.鹿茸间充质干细胞原代培养具体为：

(1)将步骤1所得组织每2-5g，放入40ml含双抗的DMEM培养基中后，再加入7-8ml50U/ml的Ⅱ型胶原酶溶液，37℃孵育10-25min；

(2)1000rpm离心5min，弃去上清液，按步骤(1)中组织每2-5g加入10mlDMEM完全培养基，混匀，重复本步骤1次，1000rpm离心5min，弃去上清液；

(3)将步骤(2)所得组织块铺在75cm²培养瓶中，加入5ml DMEM完全培养基，倒置放入CO₂培养箱中进行培养，培养条件为37℃，5％(v/v)CO₂，4-5h后将培养瓶翻转过来，加入10ml DMEM完全培养基继续培养，培养条件不变；

(4)待细胞长满培养瓶底部得到鹿茸间充质干细胞的原代细胞。