[发明专利]一种基于碱基淬灭荧光原理实现低成本高通量核酸适配体最优序列的优化方法

说明书

一种基于碱基淬灭荧光原理实现低成本高通量核酸适配体最优序列的优化方法属于分子生物学领域，包括：将已获得长链核酸适配体分成若干个含有G碱基的段；对含有G碱基的段分别设计互补序列，使互补序列的3’端的对位有突出的G碱基；设计合适的互补短链的长度；将核酸适配体与靶标分子在结合溶液中反应后，加入荧光素标记的互补短链，根据荧光强度判断各个区域对结合的影响，判断结合区域；以与中心结合区域互补的探针为指示，通过截短、分割等手段获得能与靶标分子结合的最短核酸序列。本发明优化方法更快速，所需标记的荧光序列少，标记荧光探针具有通用性，可同时对多条核酸序列进行优化及新设计的核酸适配体序列进行结合能力进行表征。

技术领域

本发明属于分子生物学领域，涉及一种基于碱基淬灭荧光原理实现低成本高通量核酸适配体最优序列的优化方法。

背景技术

核酸适配体(Aptamer，也译为核酸识体、核酸适体、适配体)是指通过指数富集配体系统进化法(systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX)，从人工合成的DNA或RNA文库中筛选出来的、能够对靶标高亲合性地结合和高特异性识别的单链寡核苷酸。随机文库的基本序列结构包括：中间随机序列长度为35-60个碱基，两端用于扩增的引物长度为约20个碱基。最终筛选到的核酸适配体的总长度约60-100个碱基。

核酸适配体可以形成独特的三维结构，这使得核酸适配体可以更好地和靶标相结合，核酸适配体的靶标小到离子、单分子，大到整个细胞。核酸适配体对于靶标具有很好的选择性和很强的亲和力，这使其具有超过传统识别元素的优势，在某种程度上可以与抗体相媲美。因此核酸适配体替代传统抗体在多种疾病的基础研究、药物筛选、临床诊断及疾病治疗中具有广泛的应用前景。

在已报道研究中发现核酸适配体长度过长不利于形成稳定的结构，且易引起不必要的碱基错配，从而影响识别过程。而通过去除与识别区域不相关对的非必需序列，仅保留识别的核心区域，可以使核酸适配体长度大大缩短，并提高核酸适配体与靶标结合的亲和力和特异性，便于后续研究，同时也节省了合成成本。当前，已被广泛应用的核酸适配体，例如凝血酶适配体、ATP适配体、IgE适配体等，其核心序列长度在15-30个碱基水平。现有大量已筛选出的核酸适配体由于序列过长无法获得充分利用，因此对于筛选到的核酸适配体进行序列优化，已成为其进一步应用必经之路，而且是亟待解决的难题。

对核酸适配体进行序列优化的方法包括生物信息学预测法、酶切保护实验、芯片分析法等。生物信息学预测法是基于热力学最小自由能等算法预测核酸适配体的二级结构，但由于各算法可预测到的核酸二级结构十分有限，其可靠性难以保证；酶切保护实验是利用核酶水解核酸适配体与靶标结合的复合物，这样可以得知核酸适配体与靶标结合的部分序列，但该方法无法得知核酸适配体中对稳定性起关键作用的非结合序列；芯片技术是将核酸适配体的截短片段制成芯片，利用荧光修饰靶标与芯片的结合信号，优选亲和力更好的优化序列，该方法准确性高，但成本过于昂贵。由于目前对于核酸适配体进行序列优化尚缺乏快速、准确、令人满意的方法，大量筛选到的核酸适配体因为缺乏有效优化而序列过长，从而限制了其广泛应用。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有技术中操作负责，成本高等问题，提供一种基于碱基淬灭荧光原理实现低成本高通量核酸适配体最优序列的优化方法。

为了达到上述目的，本发明提供的技术方案是：

一种基于碱基淬灭荧光原理实现低成本高通量核酸适配体最优序列的优化方法，包括互补序列位置的优化，互补序列长度的优化，以及核酸适配体最优序列的优化，具体包括以下步骤：

(1)将已获得长链核酸适配体分成若干个含有G碱基的段，其中每一个段至少含有一个G碱基。所述的长链核酸适配体作为候选核酸适配体，为一种序列或多种序列，包括60-100个碱基。