[发明专利]一种不受泛素化蛋白酶体降解的突变PCV2病毒及其制备方法和应用

说明书

本发明提供一种不受泛素化蛋白酶体降解的突变PCV2病毒及其制备方法和应用，对猪圆环病毒2型(PCV2，GenBank No.EU366323)毒株Cap的三个位点(164K、179K、191K)突变，使得突变的PCV2不能被MKRN1介导的泛素化降解，并且可通过感染性克隆进行高速复制，毒价高于野生型的PCV2毒价。通过感染性克隆获得的突变病毒可以更好的研究PCV2的致病机制，并为PCV2暴发提供潜在的控制措施。

技术领域

本发明涉及pMKRN1介导的猪圆环病毒2型(PCV2)毒株Cap泛素化，具体涉及与pMKRN1泛素连接酶作用相关的氨基酸位点突变的PCV2的构建。

背景技术

猪圆环病毒相关性疾病(porcine circovirus associated disease,PCVAD)是由猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2,PCV2)引起的，主要包括猪皮炎肾病综合征(porcine dermatitis and nephropathy syndrome,PDNS)、仔猪传染性先天性震颤(congenital tremors,CT)和断奶仔猪多系统衰竭综合征(postweaning multisystemicwasting syndrome,PMWS)等多种疾病。虽然PCV2能在PK-15细胞中复制，但是一直不能高速繁殖，这对PCV2致病机制的研究造成障碍。如何提高PCV2复制能力是目前研究其致病机制亟待解决的问题之一。

研究表明，人的MKRN1对包括病毒蛋白在内的多种底物蛋白具有E3泛素连接酶的作用。但对于PCV2而言，目前仅报道了PCV2在PK-15细胞中与porcine MKRN1(pMKRN1)结合。pMKRN1结合后对于PCV2包括的主要结构蛋白成分，即其衣壳蛋白(Cap)有怎样的作用，带来怎样的影响，并未得到研究。PCV2的Cap是由234个氨基酸(aa)组成的单肽链蛋白，其具体氨基酸序列可以参考“Ultrasensitive Detection of RNA and DNA VirusesSimultaneously Using Duplex UNDP-PCR Assay”，其包含11个赖氨酸。目前发现的PCV2毒株主要包括2a亚型、2b亚型，比对分析2a亚型与2b亚型发现164位和179位的赖氨酸高度保守，191位氨基酸不同。

发明内容

本发明的目的在于提供一种不受泛素化蛋白酶体降解的突变PCV2病毒及其制备方法和应用。该病毒毒株具有感染活性，可在PK-15细胞中高速复制，从而可以替代野生型PCV2来研究PCV2致病机制和疾病药物的开发。

为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：

一种突变的PCV2病毒，该PCV2病毒的衣壳蛋白(Cap)在宿主体内的泛素化蛋白酶体途径的降解中保持完整性。

所述泛素化蛋白酶体途径的降解或泛素化由猪MKRN1蛋白(pMKRN1)介导。

所述PCV2病毒的突变位点位于野生型PCV2病毒的衣壳蛋白(Cap)上与泛素(Ub)分子结合的氨基酸位点的编码序列处。

所述氨基酸位点选自野生型PCV2病毒(2b亚型)的衣壳蛋白(Cap)自氨基端起第164、179及191位赖氨酸中的一个、两个或三个；通过突变，所述第164、179及191位赖氨酸中的一个、两个或三个变为丙氨酸，使得Cap不能被pMKRN1介导的泛素化蛋白酶体途径降解。

所述突变的PCV2病毒的序列如SEQ.ID.NO.1所示。

上述突变的PCV2病毒的制备方法，包括以下步骤：