[发明专利]一种检测克罗诺杆菌的免疫磁珠层析试纸条及快速检测方法

权利要求书

1.一种用免疫磁珠层析试纸条快速检测奶粉中克罗诺杆菌的方法，包括衬板，衬板上依次衔接设有的样品垫、硝酸纤维膜和吸水垫，所述硝酸纤维膜上设有隐形的检测T线和对照C线，其特征在于：

所述检测T线由100 μM的长度20 bp的捕获探针、5 mg/mL链霉亲和素和50 mM的磷酸盐缓冲液按体积比1∶1∶6混匀的捕获探针溶液制成，所述捕获探针的DNA序列为：5'-Biotin-GGCGGAGCCGAATAACTGGG-3'；

所述对照C线由抗牛血清白蛋白抗体溶液和磷酸缓冲液混匀的浓度1～5 mg/mL的标准溶液制成；

用所述的免疫磁珠层析试纸条快速检测奶粉中克罗诺杆菌的操作步骤如下：

（1）提取奶粉中的DNA

（1.1）奶粉均质液的制备

将奶粉按照1:9比例进行稀释，得到奶粉均质液；增菌培养，获得奶粉均质液；

（1.2）奶粉均质液的裂解

将奶粉均质液离心分离，取沉淀物，加入细菌裂解液，震荡裂解沉淀物，得到奶粉均质液的裂解物；

（1.3）磁性纳米粒子吸附

向奶粉均质液的裂解物中加入溶有磁性纳米粒子的吸附缓冲液，吸附均质液的裂解物中DNA，磁性分离去上清，得到吸附DNA的磁性纳米粒子；

（1.4）洗涤去杂

用70%的乙醇溶液洗涤吸附DNA的磁性纳米粒子两次，去除蛋白质杂质，得到洗涤物；

（1.5）溶解DNA

将洗涤物用洗脱液溶解，涡旋混匀，磁性分离取上清，即得奶粉的细菌DNA溶液；

（2）聚合酶链反应

利用已合成好的分别修饰了生物素的上游引物和FITC的下游引物，以及奶粉的细菌DNA溶液进行聚合酶链反应，得到聚合酶链产物；

所述上游引物：5'-Biotin-CGTGCCCTGCATGAGAAAA-3'

所述下游引物：5'-GGCGGAGCCGAATAACTG-3’；

（3）电泳确证聚合酶链产物

将聚合酶链产物进行琼脂糖电泳确证PCR扩增，若电泳图上出现条带，根据电泳图中的条带对比Marker得出PCR产物长度，与所查得目的片段为673 bp扩增片段，若两者碱基数完全一致则表示PCR过程成功，可用于免疫试纸条检测；若两者碱基数不一致，则需优化PCR参数直到对比结果一致；若电泳图上没有出现条带，则表示奶粉中不含有所需检测的克罗诺杆菌；

（4）PCR产物与免疫磁珠结合

将聚合酶链产物和免疫磁珠按体积比1∶4混合反应30 min，由于PCR产物一端含有生物素，反应30 min，使免疫磁珠上的链霉亲和素与聚合酶链产物产物中的生物素充分结合；磁性分离去上清，用50 μL 0.15 M的氯化钠溶液清洗三次，用上样液重悬至所需体积50-200μL，得到被检测液；在均相液相中进行功能化磁珠与扩增产物的结合，可以保证反应的效率，避免了在试纸条固相界面反应不充分的弊端；利用磁性纳米粒子的性能可以实现方便分离纯化，无需在侧向层析试纸条特意设计结合垫，节省了检测成本和简化了试纸条检测制备工艺；

所述免疫磁珠由5-20 μL 5 mg/mL的链霉亲和素与100 μL 25-50 mg/mL的带羧基的纳米磁珠偶联制备；

（5）免疫磁珠层析试纸条的快速检测

将被检测液滴加于免疫磁珠层析试纸条的样品垫上，被检测液在毛细管作用下从试纸条上流过，室温反应10 min，即可观察结果；

若被检测液中存在克罗诺杆菌基因，则被检测液中的磁标偶联物会直接泳动到检测T线和硝酸纤维膜上的链霉亲和素发生反应，从而使磁珠颗粒发生聚集，形成黄色的线条；其他未结合的磁标偶联物继续通过毛细管作用向前泳动，与对照C线上的牛血清白蛋白抗体发生第二次反应，同样形成黄色线条，这样NC膜上就会出现两条黄色线条，表示被检测液为阳性，其颜色强弱取决于被检测液中目标物含量的多少；最后通过测定检测T线上捕获磁珠的含量实现判断出被奶粉中克罗诺杆菌的菌落数；

若被检测液中不存在克罗诺杆菌基因，则被检测液中的磁标偶联物直接泳动到对照C线处，检测T线处就不会发生磁珠颗粒的聚集，即不会出现黄色的线条；对照C线是为检验磁标免疫层析方法本身是否有效而设定的，所以无论样品中是否存在目标物，对照C线都应该显黄色；这样NC膜上就会出现一条黄色线条，表示被检测液为阴性；如果对照C线不显现出黄色，则说明试纸条失效。