[发明专利]一种检测克罗诺杆菌的免疫磁珠层析试纸条及快速检测方法

说明书

本发明涉及一种检测克罗诺杆菌基因的免疫磁珠层析试纸条。试纸条的硝酸纤维膜上设有检测T线和对照C线，检测T线由100μM的长度20 bp的捕获探针、5 mg/mL链霉亲和素和50mM的磷酸盐缓冲液按体积比1∶1∶6混匀的捕获探针溶液制成；对照C线由抗牛血清白蛋白抗体溶液和磷酸缓冲液混匀的浓度1～5 mg/mL的标准溶液制成。用于检测奶粉中是否存在克罗诺杆菌时，将被测奶粉通过细菌DNA提取、聚合酶链反应、PCR产物与免疫磁珠结合制得被检测液；将被检测液滴加于免疫磁珠层析试纸条的样品垫上，室温反应10 min，即可观察结果。若检测T线和对照C线均显示黄色线条，表示被检测液为阳性；若对照C线显示黄色，表示被检测液为阴性。对实际样品的检测反应时间缩短至8‑11 h。

技术领域

本发明属于克罗诺杆菌基因检测技术领域，具体涉及快速检测克罗诺杆菌基因的免疫磁珠层析试纸条及其制备方法。

背景技术

克罗诺杆菌（又称阪崎肠杆菌）是肠杆菌科的一种，能引起严重的新生儿脑膜炎、小肠结肠炎和菌血症，死亡率高达50% 以上。克罗诺杆菌已引起世界多国相关部门的重视。据报道，国外乳业巨头曾因此被召回产品。在美国FDA2002年在本土某一些国际乳业巨头生产的婴儿配方奶粉中检出克罗诺杆菌后，2003年又一家国际乳业巨头公司主动召回在美国生产的一批检出极微量克罗诺杆菌的罐装早产儿特殊配方奶粉，克罗诺杆菌从此成为世界瞩目的焦点。

聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，简称PCR）原理凭借敏感、特异、快速的特点荣获1993年诺贝尔化学奖。因其在病原体检测方面的独特优势，因而发达国家在相关方法和仪器方面的研发非常快，成为分子生物学诊断的主流，至今仍处于学术和应用前沿。酶联免疫吸附试验（Enzyme-linked Immuno-sorbent Assay，简称为ELISA）和胶体金免疫层析法（Colloidal Gold Irnmuno-Chromatography Assay，简称为GICA）由于其廉价，特异，灵敏和快速等特点，被广泛地使用于致病菌的快速检测中。但ELISA试剂需要专用的实验室和专业人员进行检验，操作复杂，时间较长；胶体金类试剂操作简便、快速、适于现场检测，但灵敏度稍低，结果用肉眼直接观察，会产生误差，亦不能记录。

纳米免疫磁珠是含有铁元素的超顺磁纳米颗粒，外面包覆着聚乙烯类高分子物质，并可带有羧基或氨基，用于和蛋白质分子交联。免疫磁珠在细胞和大分子分离、纯化及诊断上都已得到应用。免疫试纸条是一种制作简便、操作简单并且适宜于现场快速检测的技术，一般主要有两种方法：夹心法和竞争法，前者一般适用于检测大分子物质，后者适于检测小分子物质。试纸条上喷有检测线和质控线。夹心法是指当有目标物存在时，目标物流经试纸条上两条线时，会被捕获在检测线上，两条线都出现表示为阳性，只有质控线即为阴性。而竞争法是指有目标物存在时，检测线则不显线，即为阳性，只会出现质控线，两条线都出现表示为阴性。

发明内容

为了实现快速、灵敏、简便地检测出婴幼儿乳粉中的克罗诺杆菌，本发明提供一种检测克罗诺杆菌基因的免疫磁珠层析试纸条，同时提供一种奶粉中克罗诺杆菌的快速检测方法。

一种检测克罗诺杆菌基因的免疫磁珠层析试纸条包括衬板，衬板上依次衔接设有的样品垫、硝酸纤维膜和吸水垫，所述硝酸纤维膜上设有隐形的检测T线和对照C线；

所述检测T线由100 μM的长度20 bp的捕获探针、5 mg/mL链霉亲和素和50 mM的磷酸盐缓冲液以体积比1∶1∶6混匀的捕获探针溶液制成，所述捕获探针的DNA序列为：5'-Biotin-GGCGGAGCCGAATAACTGGG-3'；

所述对照C线由抗牛血清白蛋白抗体溶液和磷酸缓冲液混匀的浓度1～5 mg/mL的标准溶液制成。

用上述的免疫磁珠层析试纸条快速检测奶粉中克罗诺杆菌的操作步骤如下：

（1）提取奶粉中的DNA

（1.1）奶粉均质液的制备