[发明专利]一种牙髓间充质干细胞的培养方法

权利要求书

1.一种牙髓间充质干细胞的培养方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1、准备牙髓样本：将牙齿样本浸泡在缓冲溶液或将牙齿样本冷藏保存，其保存时间在40h~47h，其后劈开牙冠，取出牙髓;

S2、分离培养牙髓间充质干细胞:用0.01M冻存液PBS冲洗后，将取出的牙髓剪成约1mm³×1mm³×1mm³小块，再用0.3%的I型胶原酶和0.4%的分解酶在37℃中消化1h，轻轻吹打离散单细胞团块，将形成的单细胞悬液通过孔径为70μm的细胞筛网后800r/min离心5min；

再用0.01M冻存液PBS冲洗一次，将细胞沉淀，同时将密度5000/cm²的干细胞培养基接种于培养瓶中培养，每3d换液1次；

S3、克隆化培养分离牙髓间充质干细胞：待细胞生长达80％~85%汇合度时，用0.25%的胰酶消化传代，再用0.01M冻存液PBS冲洗一次，将细胞沉淀，同时将密度5000/cm²的干细胞培养基接种于培养瓶中培养，每3d换液1次，其中等细胞生长达80％汇合度时，用0.25%的胰酶消化收获；

S4、牙髓间充质干细胞检测：将收获的子代牙髓间充质干细胞，利用PBS重悬细胞，调整细胞密度为1×106/ml，取出1ml，加入预冷的无水乙醇2ml吹打混匀，在4℃下过夜并离心弃乙醇后再流式细胞仪上进行细胞周期检测；

S5、牙髓间充质干细胞检测染色。

2.根据权利要求1所述的牙髓间充质干细胞的培养方法，其特征在于，所述牙齿样本为19—29岁健康成人阻生完整的第三磨牙，且牙齿样本在浸泡和冷藏保存前需要对牙齿表面进行灭菌处理。

3.根据权利要求1所述的牙髓间充质干细胞的培养方法，其特征在于，牙冠劈开的深度为0.6mm~0.9mm，并利用牙冠劈开的深度，在无菌条件下，暴露出牙髓组织，之后取出牙髓。

4.根据权利要求1所述的牙髓间充质干细胞的培养方法，其特征在于，取出牙髓的手术工具为根管锉、刮匙、镊子及探针之其中任一种。

5.根据权利要求1所述的牙髓间充质干细胞的培养方法，其特征在于，所述干细胞培养基中含有15%的胎牛血清的α-MEM、5%的DMEM培养基及5%无血清培养基。

6.根据权利要求1所述的牙髓间充质干细胞的培养方法，其特征在于，在S4中，还需要用0.01M冻存液PBS冲洗两次，并用0 .5％的PI在4℃中染色30min。

7.根据权利要求1所述的牙髓间充质干细胞的培养方法，其特征在于，在S5中，取生长良好的克隆化培养细胞做细胞爬片，用LSAB法行抗 Vimemin、CD44、ON、DSP免疫组化染色。

8.根据权利要求1所述的牙髓间充质干细胞的培养方法，其特征在于，在S2和S4中的离心后还包括过滤除菌的步骤。

9.根据权利要求1所述的牙髓间充质干细胞的培养方法，其特征在于，所述培养瓶为转瓶、生物反应器或T75培养瓶。

10.根据权利要求1所述的牙髓间充质干细胞的培养方法，其特征在于，所述FBS和牙髓间充质干细胞的条件培养基的提及比为4：5。