[发明专利]一种牙髓间充质干细胞的培养方法

说明书

一种牙髓间充质干细胞的培养方法，包括如下步骤：准备牙髓样本，分离培养牙髓间充质干细胞，克隆化培养分离牙髓间充质干细胞，牙髓间充质干细胞检测，牙髓间充质干细胞检测染色。本发明的有益效果在于：1、利用克隆分离培养的细胞之间排列紧密，中心部细胞界限不清。呈圆形或不规则状及形成细胞结节样，周边部细胞呈多角形或短梭形，胞浆较少，核浆比例大，核仁明显，部分细胞呈成纤维状；2、不会产生严重的免疫排斥问题；3、取材方便安全和交叉感染风险小，可以用于修复缺损牙齿及牙齿再生；4、可促进皮肤伤口愈合及再生，延缓衰老或治愈失明，此外，牙髓干细胞还可治疗心脏病、类风湿性关节炎、烧伤、中风或软骨受损等，用途广泛。

技术领域

本发明涉及生物医学工程领域，特别涉及一种牙髓间充质干细胞的培养方法。

背景技术

1999年，《Science》将人类胚胎干细胞研究成果评为当年世界十大科技进展之首，2000年，《Time》周刊将其列为20世纪末世界十大科技成就之首，并认为胚胎干细胞和人类基因组将同时成为新世纪最具发展和应用前景的领域。至此干细胞研究成为近年来生物学以及医学领域中最引人注目的热点之一。干细胞是在生物个体的生长和发育中起“主干”作用的原始细胞，是一种具有自我更新、高度增殖和多向分化潜能的细胞群体，它包括胚胎干细胞和成体干细胞。虽然胚胎干细胞能分化成各种细胞类型，但这种分化是“非定位性”的，而且存在伦理道德等方面的问题。成体干细胞则不存在着伦理、法律、免疫排斥反应等问题，同时具有取材方便、来源广等优点，因而，成体干细胞在组织工程、基因治疗及个体化治疗的研究中具有较好的临床应用前景。

其实，干细胞的来源非常广泛。包含乳牙、骨髓、脐带血、脐带、智齿等，但不同组织的干细胞使用时是有区别的。目前市场上主要的产品为脐带血、脐带衍伸的干细胞储存，虽然其中含有丰富的干细胞，但局限于胎儿分娩出时的那一瞬间来实现收集，保存。而乳牙牙髓干细胞的活性是骨髓干细胞3倍，且可多向分化成结缔组织、神经、骨骼、肌肉、牙齿等组织细胞，应用前景非常广阔。

牙髓组织位于牙齿内部的牙髓腔内，是牙体组织中唯一的软组织。经研究，科学家发现了一种与骨髓间充质干细胞有着极其相似的免疫表型及形成矿化结节能力的细胞，细胞中形态呈梭形，可自我更新和多向分化，有着较强的克隆能力。这些由牙髓组织中分离出的成纤维状细胞就称为牙髓干细胞。

“每颗牙齿都包含着丰富的干细胞‘资源’，在健康时储存下来，将来在有疾患需要时培育分化干细胞，甚至可以救命。”

我国达到世界卫生组织牙齿健康标准的人口不足1％，17岁以下者，缺失一颗或更多牙齿的情况的人占7％，年龄大于50岁者，平均缺牙数目为12颗，一般成人曾接收口腔内牙齿修复体约占85％。

保存健康种子，从牙髓干细胞储存开始，人的牙髓组织中存在的具有自我更新能力、高度增生能力、多相分化潜能的成体干细胞，即牙髓干细胞(Dental pulp stem cells,FPSCs)。

牙髓干细胞属于间充质干细胞，而且是活性最强的间充质干细胞，活性的骨髓干细胞的3倍。少量牙髓干细胞就能分裂出千千万万细胞。分化能力非常强，在合适的体内或体外环境下可以分化成为骨细胞、脂肪细胞以及肝细胞等多种人体细胞，为组织、器官修复和移植提供了新的细胞来源。

牙髓干细胞，既能保持自身未分化状态和增殖能力，又可在适合的条件下分化成多种功能细胞或组织器官，例如牙周组织、神经、肌肉和脂肪细胞等，为深受牙齿疾病困扰或为其感到担忧的人们带来新的希望，并随着疾病研究范围扩大，将来糖尿病，脊髓损伤，中风，心脏瓣膜病，牙周病等都有望利用牙髓干细胞得到治疗。

目前，普通的技术是通过酶消化法原代培养牙髓干细胞，这样培养出的人牙髓干细胞贴壁慢、生长慢。4h贴壁约70％。12h开始伸展。48h基本展开。细胞呈大多数为长梭形成纤维状，1～2个突起，少数为多角形、纺锤状或椭圆形，体积较小.胞体丰满，约10～ 12d达到90％。

发明内容